蘆丁電化學檢測及其水解過程監測研究*

王玉華，朱瑞娟，王曉環，王俊青，孫新堂，2，王成森，2

（1.山東畜牧獸醫職業學院，山東 濰坊 261061；2.濰坊市獸用生物發酵技術重點實驗室，山東 濰坊 261061）

0 引 言

蘆丁水解可制備槲皮素，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等生物活性［1］，應用前景較廣。目前，檢測蘆丁或槲皮素的技術手段有高效液相色譜法［2］、液-質聯用法［3］、熒光法［4］、電化學分析法［5，6］等。相比之下，電化學分析方法用到的檢測設備成本低，儀器操作簡單，響應快，檢測過程較少用到有毒有害揮發性試劑［7］。

石墨烯（graphene，GR）具有優良的導電性［8］，是常見的電極修飾材料，但分散于水溶液時易發生不可逆團聚［9］，導致導電性能下降。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）層間的含氧基團產生靜電斥力使其在水溶液中較穩定的存在，GO修飾于電極表面后，再通過電還原制備GR［10］可避免GR的團聚，從而較好地保留GR 的優異性能。另外，基于GR的納米復合材料展現出了更好的電催化活性、靈敏性和選擇性［11，12］。

本文首先將GO修飾碳糊離子液體電極（CILE），干燥后浸于氯金酸（HAuCl4）溶液中，于陰極電位下進行恒電位沉積，金（Au）被沉積在電極表面，同時GO也被原位還原，從而構建了基于Au增敏GR復合材料的Au-rGR／CILE 電化學傳感器，Au-rGR／CILE 在蘆丁的檢測中展現了較高的催化性和選擇性，獲得了檢測蘆丁的工作曲線。AurGR／CILE能實現對蘆丁和槲皮素的同時檢測，進一步應用于蘆丁水解為槲皮素的在線檢測，為黃酮類活性成分的定性定量檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

石墨粉（≥98.5%，西隴科學股份有限公司）；液體石蠟（分析純，煙臺遠東精細化工有限公司）；正丁基吡啶六氟磷酸鹽（BPPF6，＞99%，中科院蘭州物化所）；HAuCl4（麥克林）；蘆丁（分析對照品，麥克林）；GO，根據文獻［13］合成）；不同pH值的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）作為支持電解質；蒸餾水。

電化學工作站（上海辰華CHI660E型）；工作電極（AurGR／CILE）；參比電極（飽和甘汞電極）；對電極（鉑（Pt）電極）；掃描電子顯微鏡（日本電子公司JSM-6700F型）；酸度計（上海雷磁pHS-3E型）。

1.2 電極制備與修飾

根據文獻［14］制備CILE 作為基底電極。將GO 分散于蒸餾水中，超聲15 min得到0.8 mg／mL的GO分散液。取10 μL 上述分散液滴涂于CILE 表面，晾干后浸入含2.0 mmol／L HAuCl4的PBS 中，磁力攪拌下于-1.50 V 電位下恒電位沉積300 s，蒸餾水沖洗后N2吹干，一步構建得到Au-rGR／CILE。rGR／CILE在空白PBS 中按相同步驟制得。

2 結果與討論

2.1 電極表征

以鐵氰化鉀（K3［Fe（CN）6］）為分子探針對3 種電極進行循環伏安表征，結果如圖1 所示。CILE 上氧化還原峰電流（Ip）信號較小；在rGR／CILE上的電流信號增加了約為裸電極的3倍，說明電還原得到的GO具有優良的導電性，能加快分子探針在電極表面的電子轉移速率。Au-rGR／CILE上的Ip信號較CILE和rGR／CILE均有增加同時峰電位差減小，表明Au 納米粒子產生了增敏效應，與GR 共同提高了電極的導電性和催化性。

圖1 CILE，rGR／CILE和Au-rGR／CILE的循環伏安曲線（掃速100 mV／s）

圖2 為掃描電子顯微鏡對CILE、rGR／CILE、Au-rGR／CILE表面形貌的掃描電鏡圖。由圖中可看出，圖2（a）的界面較為緊密均一，說明石墨粉被液體石蠟和離子液體均勻粘合。圖2（b）的界面呈現出折疊和褶皺，明顯與圖2（a）的不同，說明GO可在恒電位條件下被還原。在圖2（c）的界面上，可看到Au納米顆粒和GR 相互穿插，能夠增加電極的比表面積。

圖2 CILE，rGR／CILE，Au-rGR／CILE的掃描電鏡圖

2.2 單因素下蘆丁的電化學行為研究

圖3 （a）為50 μmol／L蘆丁在不同pH值（1.5～5.5）下PBS中的電化學行為。由圖可知，緩沖溶液pH 值增大，蘆丁的氧化還原峰電位同時發生負移，pH值2.0 時蘆丁的電信號最大。pH值1.5～5.5 范圍內，勢電位（E0′）與pH 值呈線性關系，線性回歸方程為E0′（V）＝-0. 059 9pH +0.671（γ2＝0.987），方程斜率接近理論值-0.057 6 V／pH，表明蘆丁在Au-rGR／CILE上的電化學反應過程是等電子等質子的。

圖3 50 μmol／L蘆丁在Au-rGR／CILE上不同pH值、掃速下的循環伏安曲線

圖3（b）為50 μmol／L的蘆丁在不同掃速（0.03～0.3 V／s）下的循環伏安行為，由圖可知，掃速（v）增大，氧化峰電流（Ipa）和還原峰電流（Ipc）增大，并伴隨著氧化峰正移（Epa）和還原峰負移（Epc）。線性回歸方程為Ipa＝-241.7v1／2+27.97（γ2＝0.976），Ipc＝215.5v1／2-28.67（γ2＝0.993）。峰電壓（E）與掃速的自然對數（lnv）的線性回歸方程為Epa＝0.010 9lnv+0.617（γ2＝0.978），Epc＝-0.009 17lnv+0.513（γ2＝0.976）。根據公式

式中α為電子傳遞系數，n為電子轉移數，ks為表觀異相電子轉移速率常數。結合線性方程計算各電化學參數，得到α為0.54，ks為2.77 s-1，n為2。

以上說明蘆丁在Au-rGR／CILE表面上的電極反應是兩電子兩質子的擴散控制過程。

2.3 工作曲線

圖4（a）為pH值2.0，掃速0.1 V／s條件下，蘆丁在AurGR／CILE上的微分脈沖伏安（differential pulse voltammetry，DPV）曲線。圖4（b）為在0.06～50.0 μmol／L 內，工作曲線為Ipa＝0.505c+1.17（γ2＝0.988）；在50.0～400 μmol／L內，工作曲線為Ipa＝0.272c+16.0（γ＝0.999），檢測限為0.017 μmol／L（3σ），低于報道值 0. 03 μmol／L［15］，0.028 μmol／L［16］，0.07 μmol／L［17］，表明Au-rGR／CILE 對蘆丁的檢測具有較高的靈敏度。

2.4 蘆丁水解過程的在線檢測

蘆丁在酸性介質中可以水解得到槲皮素，蘆丁酸性條件下的水解反應式如下

圖5 為蘆丁和槲皮素在pH值2.0 PBS中的DPV曲線，兩者的氧化峰電位差約為100 mV，說明Au-rGR／CILE對蘆丁和槲皮素能實現同時檢測，可為蘆丁的水解產物提供定性分析依據。

圖5 蘆丁和槲皮素標準品的DPV曲線

準確稱取蘆丁0. 3 g，溶于到100 mL 80 %甲醇+0.5 moL／L HCl溶液中，80 ℃下水浴回流加熱，每隔一定時間，移取水解混合液冷卻終止水解反應，取400 μL 水解混合液，定容于10 mL pH值2.0 PBS中進行檢測。圖6（a）為不同水解時間下水解液的DPV曲線，由圖可見，隨著水解時間的增加，蘆丁的響應信號逐漸減小，伴隨槲皮素的響應信號逐漸增加，說明蘆丁不斷水解產生了槲皮素。以ln（c／c0）對水解時間進行線性擬合，線性方程為ln（c／c0）＝0.124 -0.962t（γ＝0.989），水解反應速率常數為0.962 h-1，說明蘆丁的水解符合一級動力學反應模型，為蘆丁水解過程中濃度的變化進行定量分析提供依據。

圖6 水解過程在線檢測結果

2.5 選擇性、重現性及穩定性考察

按1.2的步驟制備5支Au-rGR／CILE進行循環伏安掃描，電流信號的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于4.7%；室溫保存2周后，測得的電流信號為不低于原先的95.5%，表明自制電極的重現性和穩定性較好。

3 結 論

采用恒電位法制備了Au-rGR 復合膜修飾CILE，利用該修飾電極獲得了檢測蘆丁的工作曲線，檢測濃度范圍為0.06～400. 0 μmol／L，檢測限為0. 017 μmol／L（3σ），表明Au-rGR／CILE對蘆丁的檢測具有較高的靈敏度。在溫度80 ℃下，80%甲醇+0.5 mol／L HCl 溶液中，蘆丁的水解符合一級反應動力學模型，水解常數為0.962 h-1，為蘆丁水解過程中黃銅類物質的定性定量檢測提供參考價值。