MYBL2在淋巴結陽性前列腺癌組織中的表達及其對雄激素剝奪治療結局的預測作用

付國,程繼,高丹

(陜西省人民醫院 泌尿外科,陜西 西安 710068)

前列腺癌(PCa)是一種高度異質性腫瘤,盡管在診斷和治療策略方面取得了巨大進步,但它仍是男性癌癥相關死亡的主要原因[1]。根治性前列腺切除術(RP)是局部晚期PCa的一線治療選擇之一[2]。在接受RP和盆腔淋巴結清除術(PLND)的所有PCa患者中,部分患有病理性淋巴結陽性(LNP)疾病,LNP與預后不良密切相關[3]。對于LNP-PCa患者,指南建議輔助雄激素剝奪治療(ADT)[4]。然而,ADT的耐藥性仍然是一個臨床挑戰。因此,有必要更好地了解耐藥性的驅動因素,以制定為LNP-PCa患者提供長期臨床益處的治療策略。能及早預測LNP并識別對ADT反應的預測性生物標志物具有重要的臨床意義。骨髓母細胞增生癥病毒癌基因同源樣蛋白2(MYBL2)是MYB轉錄因子家族成員之一,在細胞周期進展、細胞生存和惡性轉化中起重要調節作用。事實上,MYBL2基因在許多癌癥中過度表達,并與患者預后不良相關[5]。MYBL2可以通過調節雄激素依賴性PCa細胞中Rho-GTPasesRhoA和LATS1激酶的活性來促進YAP1轉錄活性,進而促進去勢耐藥性生長和轉移能力[6]。因此測定MYBL2表達水平可能會影響LNP-PCa的治療選擇。本研究旨在檢測MYBL2在PCa組織中的表達水平,并調查其與LNP-PCa患者臨床病理特征和ADT輔助治療預后的關系,最后進行生存分析以評估該生物標志物的預后預測潛力。

1 對象與方法

1.1 研究對象

經我院機構審查委員會批準,共使用80份PCa標本和36份良性前列腺增生(BPH)標本進行回顧性分析。兩個隊列的研究參與者均簽署知情同意書。PCa標本是于2017年2月至2022年6月期間在我院接受RP的PCa患者中采集的,患者年齡48～82歲,平均(66.09±6.45)歲,術前血清前列腺特異性抗原(PSA)水平為23.85 ng·ml-1[四分位間距(IQR)13.74～47.89 ng·ml-1]。納入標準:(1) 經病理活檢證實為PCa,病理學樣本由泌尿生殖病理學專家審查;(2) 部分LNP-PCa患者在術后接受了輔助性ADT,最多曾接受過1次細胞毒性化療、放療或免疫治療,前提是這些治療在ADT開始前4周停止;(3) 東部腫瘤協作組(ECOG)表現狀態≤2分,符合血液學和實驗室標準,包括血清鉀≥3.5 mmol·L-1,天冬氨酸轉氨酶(AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)<1.5倍正常上限(ULN),血清總膽紅素≤1.5倍ULN,左心室射血分數≥50%;(4) 有至少6個月的隨訪數據。排除標準:患者可能曾接受過任何數量的激素治療(包括抗雄激素、類固醇、雌激素、非那雄胺、度他雄胺和酮康唑);合并無法控制的并發癥、肝病、垂體或腎上腺功能障礙;入組前6個月內出現過臨床顯著的心血管事件或血栓栓塞以及可能干擾藥物吸收的胃腸道疾病;治療開始后1個月內進行手術或局部前列腺介入治療;治療后隨訪失敗。作為良性對照,從因癥狀性BPH而接受經尿道前列腺電切術(TURP)的患者中采集了36份冷凍的良性前列腺標本,患者年齡43～81歲,平均(65.53±10.34)歲,血清PSA水平為4.56 ng·ml-1(IQR 1.89～8.36 ng·ml-1)。

1.2 治療及隨訪

所有PCa患者均接受RP作為初始治療。64例患者(80.0%)接受了機器人輔助腹腔鏡前列腺切除術,16例患者(20.0%)接受了經恥骨后RP。27例經病理證實LNP的患者接受了局限性或擴大PLND,術后進行輔助性ADT,接受阿比特龍(1 000 mg·d-1)和潑尼松(5 mg·d-1)治療2個4周療程后,加入高劑量度他雄胺(3.5 mg·d-1),直到研究退出或疾病進展。根據醫生的判斷,患者接受定期PSA監測和診斷成像[腹部和骨盆的計算機斷層掃描和(或)骨盆的磁共振成像,以及骨骼掃描]。

1.3 回顧性資料收集

回顧性收集臨床和病理數據,包括患者年齡、首次診斷日期、診斷時的基線Gleason評分(GS)和PSA、進展和死亡日期(如有)。生化復發(BCR)定義為手術后兩次連續測量的PSA值大于0.2 ng·ml-1。臨床進展(CP)定義為隨訪期間X線檢查證實的疾病(局部復發或遠處轉移)。無進展生存(PFS)時間定義為從ADT治療開始到BCR、CP或死亡的時間,或報告患者存活且無疾病進展的最后隨訪日期。

1.4 免疫組化檢測

用二甲苯和分級醇對5 μm厚的福爾馬林固定石蠟包埋組織切片進行脫蠟,并用3%H2O2淬滅內源性過氧化物酶活性。將載玻片與MYBL2一級抗體(美國Thermo Fisher Scientific公司)以1∶500的比例孵育。二級抗體以1∶300的比例稀釋后額外避光孵育1 h。用奧林巴斯CX41RF顯微鏡拍攝抗體標記照片。在細胞核和細胞質中觀察MYBL2的陽性染色。每次評估隨機選擇5個視野,并以400倍放大率觀察(每個視野至少有200個細胞)。根據陽性細胞的百分比(陰性為0分,<10%為1分,10%～50%為2分,51%～80%為3分,>80%為4分)和染色強度(陰性為0分,弱為1分,中等為2分,強烈為3分)的乘積表示免疫反應性評分(IRS),最終IRS 0～1分被視為陰性,IRS≥2分被認為陽性。

1.5 TCGA前列腺癌數據挖掘

泛癌和基因型-組織表達(GTEx)數據庫的MYBL2基因表達數據來自TIMER2.0(http:∥timer.comp-genomics.org/)。PCa數據集(551個樣本,轉錄組RNA-seq數據)的mRNA表達數據和臨床信息來自癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫。利用DESeq2包探索mRNA的差異表達。調整后的P<0.05和|log2(倍數變化)|>1作為篩選差異表達基因(DEG)的閾值,用于糾正假陽性結果。應用“pROC”和“timeROC”軟件包評估MYBL2的診斷價值,并通過受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析和比較MYBL2的診斷性能。在TCGA數據庫中,根據MYBL2 mRNA表達的中位值將PCa患者分為兩組,利用R包“生存”分析兩組的生存數據,并通過R包“surviminer”描繪生存曲線(選擇“Kaplan-Meier”)。

1.6 統計學處理

所有統計分析均采用R(3.5.2版)和GraphPad Prism(8.00版)軟件。連續變量描述為均數±標準差,并行獨立t檢驗比較2組間數據差異。通過卡方檢驗或Fisher精確檢驗分析非連續變量。通過生存曲線和對數秩檢驗分析MYBL2在預測接受ADT的LNP-PCa患者PFS中的風險比(HRs)。進行多變量Cox比例風險回歸模型分析,包括GS、RP切緣和MYBL2蛋白表達作為協變量。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 組織MYBL2蛋白表達

MYBL2蛋白陽性染色呈黃棕色或棕色顆粒,位于細胞膜和細胞質中。PCa組織中陽性表達36例(45.0%),陰性表達44例(55.0%);BPH組織中陽性表達4例(11.11%),陰性表達32例(88.89%),兩組之間差異具有統計學意義(χ2=11.171,P<0.001,圖1)。

圖1 免疫組化分析MYBL2蛋白在BPH組織和高分化PCa組織中的表達情況(×400)

2.2 PCa組織MYBL2蛋白表達與患者臨床病理特征的關系

在PCa組患者中,組織MYBL2蛋白表達只與淋巴結轉移有關,LNP-PCa患者中組織MYBL2蛋白陽性表達率(63.64%,21/33)高于非LNP-PCa患者(31.91%,15/47,P=0.005)。未觀察到PCa組織MYBL2蛋白表達與年齡、體重指數、PCa家族病史、腫瘤GS分級、組織學分級、pT分期RP切緣及基線血清PSA水平之間的關系(P>0.05)。見表1。

表1 PCa患者組織MYBL2蛋白表達與臨床特征的關系 例

2.3 組織MYBL2蛋白表達與LNP-PCa患者ADT治療結局的關系

27例接受ADT的LNP-PCa患者,RP術后血清PSA水平最低值均≤0.05 ng·ml-1。術后輔助ADT中位持續時間為17.6個月(IQR 11～26個月),中位隨訪時間為33.0個月(IQR 28～40個月)。隨訪期間17例患者發生BCF,其中9例發生CP(包括1例局部復發和8例遠處轉移)。繪制Kaplan-Meier生存曲線,MYBL2陽性表達者中位PFS時間短于MYBL2陰性表達者(30.0個月vs. 64.0個月,Log-rankχ2=19.135,P<0.001),見圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析接受ADT治療LNP-PCa患者的PFS

2.4 Cox比例風險回歸分析

經單因素分析,腫瘤GS分級、組織MYBL2蛋白表達與LNP-PCa患者ADT治療后PFS有關(P<0.05),見表2。將單因素分析中P<0.01的變量包括腫瘤GS分級、RP切緣、組織MYBL2蛋白表達納入多因素分析模型,結果顯示,組織MYBL2蛋白表達仍然是影響PFS的獨立預測因素(P=0.002),見表3。

表2 單因素Cox比例風險回歸分析影響LNP-PCa患者PFS的臨床因素

表3 多因素Cox比例風險回歸分析影響LNP-PCa患者PFS的臨床因素

2.5 生物信息學分析

分析GTEx和TCGA數據庫的RNA-seq數據,結果表明,與正常樣本相比,19例PCa組織樣本(n=499)中MYBL2 mRNA水平較高(P<0.001,圖3A)。未配對表達數據分析表明,PCa組織中MYBL2mRNA表達水平顯著高于正常組織(P<0.001,圖3B);配對表達數據結果顯示,在52例PCa組織中MYBL2水平亦顯著高于相匹配的癌旁組織(P<0.001,圖3C)。此外MYBL2 mRNA高表達與更短的PFS顯著相關(P<0.001,圖3D)。

3 討 論

近年來,PCa已成為我國男性第六常見的惡性腫瘤,死亡率也高居前四位[7]。PCa在臨床上具有異質性,大多數疾病進展緩慢,但仍有部分患者可迅速發展為骨和LNP,并對ADT產生耐藥性,缺乏有效治療。LNP是局部晚期患者死亡的主要原因[8-9]。PCa的分子異質性是臨床異質性的根本原因之一[10],迄今為止的研究尚未系統地解決這一問題。在本研究中,我們將MYBL2假定為PCa的潛在生物標志物,并研究了他與PCa患者臨床病理特征以及預后之間的相關性。

MYBL2,也稱為B-myb,是骨髓母細胞增生癥家族的一種轉錄因子。它最初被鑒定為v-myb癌基因的細胞同源物,該癌基因已知會導致雞白血病[11]。MYBL2蛋白是由704個氨基酸組成的,它們形成“SWI3、ADA2、N-CoR和TFIIIB”(SANT)DNA結合域、反式激活域(TA)、保守區(CR)和調節域(RD)。DNA結合結構域和CR幾乎與A-MYB和C-MYB相同,并且在不同物種(包括人、動物、線蟲等)之間具有高度保守性[12-13]。與A-MYB(主要在B細胞、發育中的中樞神經系統細胞、胚胎中的有絲分裂活性細胞和生殖組織中表達)和C-MYB(在造血前體細胞中表達)不同,MYBL2在所有增殖細胞中都有表達[14]。從功能上講,MYBL2在調節細胞增殖、增殖細胞分化和細胞周期進展中發揮著關鍵作用[15]。據報道[6,16],miR-30a可以通過靶向MYBL2抑制PCa的雄激素非依賴性生長;并通過調節Hippo-YAP信號通路控制PCa去勢抵抗和轉移復發的發展。此外,其他一些與癌癥相關的結果[17-20]表明,MYBL2在乳腺癌、肝癌、卵巢癌和皮膚T淋巴瘤中明顯擴增,其表達水平與患者預后相關。基于這些數據,我們有理由相信MYBL2可能在PCa的發生和發展中發揮關鍵作用。在本研究中,我們首先通過IHC檢測證實MYBL2蛋白在PCa組織中陽性表達率為45.0%,顯著高于BPH組織,且PCa組織MYBL2蛋白表達與淋巴結轉移有關,LNP-PCa患者中組織MYBL2蛋白陽性表達率高于非LNP-PCa患者(58.33%vs. 27.27%,P=0.005)。

之前的幾項研究[2-4,9]表明,接受RP作為初始治療的PCa患者中,LNP與預后不良相關。然而目前對于LNP-PCa患者的最佳管理仍不清楚。國家綜合癌癥網絡(NCCN)指南描述了LNP患者輔助治療的幾種選擇,即ADT、臨床觀察或在ADT基礎上增加盆腔外照射治療(RT)。而且與LNP疾病的延遲ADT相比,建議立即給予ADT作為輔助治療[21]。然而分子異質性導致LNP-PCa患者接受ADT的治療結局不盡相同。

識別有BCR風險的患者對于指導輔助治療,從而改善預后至關重要。目前臨床上主要依靠醫生的判斷,以及腫瘤本身的風險分層來觀察結果,缺乏有效的預后標志物。在本研究中,根據Kaplan-Meier曲線和多變量Cox回歸分析,我們發現組織MYBL2蛋白表達是影響LNP-PCa患者接受ADT后BCR風險的獨立預測因素,組織MYBL2陽性表達與更短的PFS相關;這一事實證明了PCa組織中MYBL2表達升高的臨床相關性,因此我們有理由認為MYBL2是LNP-PCa的預后標志物之一,但作為治療選擇的預測生物標志物尚不成熟。本研究在患者中的觀察數據與既往的體外細胞系研究基本一致,例如,在AR陽性LNCaP細胞系中,沉默MYBL2表達可增強細胞對雄激素剝奪和紫杉醇的敏感性。此外,MYBL2的過度表達可以通過調節Rho-GTPasesRhoA和LATS1激酶的活性來促進YAP1轉錄活性,從而促進雄激素依賴性PCa細胞的去勢耐藥性生長和轉移能力;重要的是,靶向MYBL2可逆轉PCa細胞對ADT的抵抗,并阻斷了PCa細胞在體內的骨轉移[6,22]。總之,MYBL2是一種PCa細胞系ADT耐藥的候選分子機制。

研究癌癥基因的分子機制是一項長期的探索。不同腫瘤中基因的分子機制受到復雜網絡的影響。公共數據庫TCGA和GTEx的使用讓應用生物信息學工具進行癌癥分析成為可能。我們認為MYBL2可能是LNP-PCa診斷和預后的有效生物標志分子之一。因此最后我們使用了大規模的數據庫資源和統計分析,進一步系統地證明MYBL2是PCa惡性進展中的不良預后因素。我們分析了GTEx和TCGA數據庫中MYBL2mRNA表達,發現MYBL2在包括PCa在內的許多腫瘤組織中表達上調;且MYBL2 mRNA表達上調與較差的PFS呈正相關,本研究結果與之基本一致。

本研究的結果表明,PCa組織MYBL2蛋白陽性表達率顯著高于良性BPH組織,且在LNP-PCa患者的腫瘤組織中MYBL2陽性表達率更高。此外,MYBL2也是接受RP和ADT治療的LNP-PCa患者中生化復發的獨立預測因子。總之,MYBL2可能是PCa中一種新的腫瘤生物標志物,與淋巴結轉移以及LNP-PCa患者的預后相關,這為臨床靶向治療策略的發展提供了新的機會。MYBL2在促進PCa進展中的作用及其相關分子機制需要后續實驗的補充。