干露溫度對擬穴青蟹幼蟹存活、血藍(lán)蛋白和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

戚杉杉 ,史 策* ,王春琳 ,葉央芳 ,母昌考 ,李榮華 ,任志明,吳清洋

（1.寧波大學(xué) 教育部水產(chǎn)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 寧波 315832;2.浙江省海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 寧波 315832;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部綠色海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建）,浙江 寧波 315832）

干露是指水生動(dòng)物離開水體停留在空氣、沙或土壤等介質(zhì)的一種狀態(tài)[1],水生動(dòng)物離水后能存活的時(shí)間為“露空時(shí)間”.露空時(shí)間越長,表明耐干露能力越強(qiáng)[2].在生產(chǎn)過程中,干露脅迫通常發(fā)生在水生動(dòng)物運(yùn)輸過程中,隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加,干露脅迫對水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體造成的損傷會(huì)不斷加劇,最終會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡,并造成經(jīng)濟(jì)損失[3].

溫度是水生動(dòng)物生存所需的重要非生物環(huán)境因素之一,環(huán)境溫度會(huì)顯著影響變溫動(dòng)物的生理狀態(tài)[4].干露和溫度能夠共同影響甲殼動(dòng)物的生理狀態(tài),進(jìn)而影響其存活率.例如,三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)在5 ℃條件下,干露運(yùn)輸48 h,存活率可高達(dá)93%[5];錦繡龍蝦(Panulirus ornatus)在12 ℃條件下,運(yùn)輸26 h,存活率可達(dá)100%[6];日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)在25 ℃環(huán)境下,干露2 h,存活率可達(dá)93%[7];斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)在25 ℃環(huán)境下,干露1 h,存活率為85%[8].

甲殼動(dòng)物在干露脅迫下會(huì)使氧氣供給受阻[9],造成CO2積累,并導(dǎo)致呼吸性中毒,從而降低氧氣與血藍(lán)蛋白的結(jié)合能力[10].干露脅迫和高溫容易導(dǎo)致氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),而過量的ROS 會(huì)抑制DNA 聚合酶活性,并阻礙DNA 修復(fù),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生[11].甲殼動(dòng)物為應(yīng)對氧化應(yīng)激,進(jìn)化出一套強(qiáng)有力的抗氧化酶系統(tǒng),可以在干露過程中去除大量積累的ROS,保護(hù)細(xì)胞組織免受氧化損傷[12].

擬穴青蟹(Scylla paramamosain)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea),通常分布在中國、越南和日本等國沿海,其生長快速、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富,受廣大消費(fèi)者喜愛,在國內(nèi)外市場上供不應(yīng)求[13].運(yùn)輸是擬穴青蟹市場銷售活動(dòng)的重要組成部分[14],擬穴青蟹耐干露能力強(qiáng)[15],Cheng 等[16]研究了擬穴青蟹暴露于空氣中的免疫和生理反應(yīng),而顧文彬[17]研究了擬穴青蟹干露-再浸潤脅迫下的生理應(yīng)答及細(xì)胞凋亡機(jī)制,但未對不同溫度對擬穴青蟹干露狀態(tài)下存活和生理狀態(tài)的影響進(jìn)行研究.

因此,本研究比較了不同干露溫度對擬穴青蟹幼蟹的存活、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響,旨在解析擬穴青蟹對不同溫度干露的生理響應(yīng),為優(yōu)化擬穴青蟹運(yùn)輸技術(shù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)于2021 年10 月22 日開始,養(yǎng)殖地點(diǎn)在寧波大學(xué)中試基地.實(shí)驗(yàn)設(shè)置17、25、33 ℃ 3 個(gè)干露溫度組.3 個(gè)150 cm×100 cm×80 cm 的帆布池用于3 個(gè)不同干露溫度處理組,每個(gè)帆布池中有8個(gè)30 cm×30 cm×30 cm 干露容器,容器由不透明塑料板平均分成9 個(gè)相等區(qū)域,每個(gè)容器底部各放1個(gè)支架,每個(gè)處理組有8 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)7 只蟹.帆布池中水位與支架高度相平,通過加熱棒和制冷機(jī)控制帆布池水溫,以控制擬穴青蟹干露溫度.

圖1 干露實(shí)驗(yàn)裝置

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

用于實(shí)驗(yàn)的擬穴青蟹幼蟹(體質(zhì)量(32.25±13.52)g)來源于浙江三門佳順?biāo)a(chǎn)合作社,在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境暫養(yǎng)5 d,以緩解因運(yùn)輸及環(huán)境變化產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng),暫養(yǎng)水溫為22～24 ℃,海水鹽度為25‰,暫養(yǎng)期間,溶解氧＞5 mg·L—1,氨氮和亞硝酸鹽＜0.5 mg·L—1,暫養(yǎng)期間不投喂飼料.待暫養(yǎng)結(jié)束后,挑選體重相近、附肢完整的擬穴青蟹幼蟹168 只;同時(shí),將帆布池中水溫調(diào)節(jié)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)溫度,將擬穴青蟹幼蟹隨機(jī)分配到3 個(gè)大帆布池中的24 個(gè)干露容器內(nèi),每個(gè)容器放7 只,每隔12 h 觀察實(shí)驗(yàn)蟹存活狀態(tài),并統(tǒng)計(jì)記錄各處理組實(shí)驗(yàn)蟹的存活數(shù)據(jù).當(dāng)實(shí)驗(yàn)蟹附肢運(yùn)動(dòng)能力下降、口器開口并伴有發(fā)泡現(xiàn)象等狀況時(shí),則判定為死亡個(gè)體.

1.3 樣本采集

各溫度組在實(shí)驗(yàn)開始的0、24、48、96 h 進(jìn)行取樣,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在干露容器中各取1 只擬穴青蟹幼蟹,總共數(shù)量為8 只,若數(shù)量不足8 只,則至少取3只以上擬穴青蟹幼蟹.使用1.5 mL一次性注射器在擬穴青蟹幼蟹的游泳足基部抽取血淋巴,并將迅速解剖采集的實(shí)驗(yàn)蟹肝胰腺置于1.5 mL 離心管中,液氮速凍后,轉(zhuǎn)入-80 ℃下保存,以備后續(xù)分析.血淋巴經(jīng)抗凝處理后在4 ℃冰箱中靜置過夜,將靜置后的血淋巴于4 ℃條件下,3 000 r·min—1離心10 min,取上層血清并進(jìn)行分裝,分裝后于-80 ℃超低溫冰箱保存.

1.4 存活率

采用Kaplan-Meier生存曲線分析法,計(jì)算不同干露溫度組各時(shí)間點(diǎn)擬穴青蟹幼蟹存活情況.

1.5 血藍(lán)蛋白、皮質(zhì)醇和活性氧的測定

血清血藍(lán)蛋白、皮質(zhì)醇和ROS檢測采用ELISA試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司)測定.往預(yù)先包被所測指標(biāo)抗體的包被微孔中依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP(過氧化物酶)標(biāo)記的檢測抗體,然后將微孔板在37 ℃下孵育60 min,并用洗滌液徹底洗滌,在過氧化物酶和酸的作用下,用于顯色的底物TMB(四甲基聯(lián)苯胺)由藍(lán)色變?yōu)辄S色,反應(yīng)最終溶液的黃色深度與所需測得的含量成正比,單位均為ng·mL—1.

1.6 基因表達(dá)分析

實(shí)驗(yàn)蟹肝胰腺樣本在液氮環(huán)境下于研缽中充分研磨,然后取少量組織粉末(50～100 mg)放入加有1 mL Trizol 試劑(15 596 026,Invitrogen,USA)的無RNase 的EP 管中提取總RNA.用RNase-Free DNase(TaKaRa,中國)去除基因組DNA污染后,用凝膠電泳法檢測RNA 的完整性和純度.按照HiFiScript cDNA 試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司,上海)說明書的操作步驟,將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA.采用SYBR 綠色熒光染料在熒光定量PCR儀(LightCycler96,Roche 公司,瑞士)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 檢測.本研究以β-actin作為內(nèi)參基因,分別測定了bax、bcl-2、caspase-3的表達(dá)情況.根據(jù)2-ΔΔCt方法對所有定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.所用引物序列見表1[18].

表1 本研究中用于實(shí)時(shí)PCR 的特異性引物

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),采用Tukey 多重比較事后檢驗(yàn)分析,以P＜0.05 作為差異顯著水平.此外,溫度與干露時(shí)間交互作用采用雙因素方差(Two-way ANOVA)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下干露對擬穴青蟹幼蟹存活率的影響

不同溫度干露情況下擬穴青蟹幼蟹生存曲線如圖2 所示.由圖可見,隨著干露過程中溫度的升高,擬穴青蟹幼蟹死亡率增加,并隨干露時(shí)間的延長,死亡率也增加.在24、48、96 h 時(shí),17 ℃存活率分別為96.43%、89.29%、58.93%;25 ℃存活率分別為91.07%、78.57%、32.14%;33 ℃存活率分別為85.71%、50%、17.86%.17 ℃組存活時(shí)間最長為144 h,33 ℃組存活時(shí)間最短為120 h.

圖2 不同干露溫度下擬穴青蟹幼蟹生存曲線

2.2 不同溫度下干露對擬穴青蟹幼蟹血淋巴指標(biāo)的影響

不同溫度干露情況下擬穴青蟹幼蟹血淋巴血藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度變化如圖3(a)所示,可見17 ℃在干露48 h 時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05),33 ℃組在干露48 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.01),而25 ℃組在干露96 h 時(shí)血藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到頂峰(P＜0.01).不同溫度干露情況下擬穴青蟹幼蟹血淋巴皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度變化如圖3(b)所示,可見皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度在25 ℃和33 ℃組均出現(xiàn)上升趨勢,且在干露96 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.01),而17 ℃組無顯著變化(P＞0.05).不同溫度干露情況下擬穴青蟹幼蟹血淋巴ROS 質(zhì)量濃度變化如圖3(c)所示,可見ROS 濃度在33 ℃組96 h 時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05),而其他實(shí)驗(yàn)組無顯著變化(P＞0.05).

圖3 不同溫度干露對擬穴青蟹幼蟹各時(shí)間點(diǎn)血淋巴血藍(lán)蛋白(a)、皮質(zhì)醇(b)和活性氧ROS(c)質(zhì)量濃度的影響

2.3 不同溫度下干露對擬穴青蟹幼蟹的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)

不同溫度干露情況下擬穴青蟹幼蟹bax表達(dá)量如圖4(a)所示,可見在17 ℃組bax表達(dá)量在干露24 h 時(shí)達(dá)到最高(P＜0.05),33 ℃組bax表達(dá)量在干露96 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05),而25 ℃組bax表達(dá)量無顯著變化(P＞0.05).不同溫度干露情況下擬穴青蟹幼蟹bcl-2表達(dá)量如圖4(b)所示,可見各溫度組bcl-2表達(dá)量均在干露48 h 時(shí)達(dá)到頂峰(P＜0.01).不同溫度干露情況下擬穴青蟹幼蟹bax/bcl-2比率如圖4(c),17 ℃和33 ℃組bax/bcl-2比值在干露24 h 時(shí)均大于1 且顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05).不同溫度干露情況下擬穴青蟹幼蟹caspase-3表達(dá)量如圖4(d)所示,由圖可見17 ℃和33 ℃組caspase-3表達(dá)量在干露24 h 時(shí)也顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.01).

圖4 不同溫度干露對擬穴青蟹幼蟹各時(shí)間點(diǎn)bax(a)、bcl-2(b)、bax/bcl-2(c)、caspase-3(d)基因表達(dá)量的影響

2.4 溫度和干露時(shí)間對擬穴青蟹幼蟹的交互作用

表2 為采用雙因素方差分析對干露溫度、干露時(shí)間及干露溫度和時(shí)間對擬穴青蟹幼蟹各測定指標(biāo)影響的分析結(jié)果.可以看出,干露溫度對bax和caspase-3基因相對表達(dá)量無顯著影響(P＞0.05),干露時(shí)間對各指標(biāo)都有顯著性影響(P＜0.05),干露溫度和干露時(shí)間對擬穴青蟹幼蟹存活率、血藍(lán)蛋白、皮質(zhì)醇和bax基因有交互作用.

表2 雙因素方差分析結(jié)果

3 討論

本研究中,干露溫度和干露時(shí)間對擬穴青蟹幼蟹存活率均存在影響,隨著干露溫度上升,擬穴青蟹幼蟹存活率下降;在17 ℃時(shí),擬穴青蟹幼蟹在96 h 時(shí)存活率仍有58.93%,而在33 ℃時(shí),擬穴青蟹幼蟹在96 h 時(shí)存活率僅為17.86%.類似研究也同樣表明溫度升高也會(huì)導(dǎo)致三疣梭子蟹和菲律賓蛤仔在干露過程中存活率下降,在5 ℃下,三疣梭子蟹在48 h 時(shí)的存活率有93.3%,而在10 ℃條件下存活率為0%[5];溫度為15 ℃時(shí),菲律賓蛤仔在72 h 仍有85.3%的存活率,但當(dāng)溫度為25 ℃時(shí),菲律賓蛤仔在72 h時(shí)已經(jīng)全部死亡[19].與以上研究結(jié)果相似,隨著干露時(shí)間增加和溫度上升,擬穴青蟹幼蟹存活表現(xiàn)下降: 幼蟹在17 ℃條件下存活時(shí)間能達(dá)到144 h,但33 ℃條件下則僅為120 h.本研究中,不同溫度處理組是通過水浴方式達(dá)到,各處理均保持了一定濕度,因此即使在干露狀態(tài)下的擬穴青蟹存活時(shí)間仍然較長.同時(shí),由于溫度與干露存在交互作用,因此高溫和干露的共同脅迫會(huì)顯著降低擬穴青蟹存活率.

由于血藍(lán)蛋白具有輸氧功能,而干露脅迫會(huì)導(dǎo)致歐洲螯龍蝦(Homarus Gammarus)和鋸緣青蟹(Scylla serrata)[20-21]出現(xiàn)呼吸性酸中毒,進(jìn)而降低氧氣與血藍(lán)蛋白的結(jié)合能力[10].本研究中各處理組的擬穴青蟹幼蟹血淋巴血藍(lán)蛋白濃度在干露過程中總體呈上升趨勢,且33 ℃組血藍(lán)蛋白含量顯著高于其他溫度組,其原因可能是因?yàn)楦邷丶觿×说脱趺{迫,hif-1基因表達(dá)上調(diào),從而增加血藍(lán)蛋白合成[22].此外,血藍(lán)蛋白作為一種多功能蛋白,還具有免疫防御功能,因此另一種可能是溫度和干露脅迫激活了擬穴青蟹的免疫系統(tǒng),導(dǎo)致血藍(lán)蛋白水平上調(diào).

不適宜的溫度和缺氧等情況會(huì)引發(fā)水生動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)[23],而皮質(zhì)醇是應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)之一[24].本研究中25 ℃和33 ℃組的皮質(zhì)醇濃度在干露過程中顯著增加,而且ROS 含量也隨之上升,表明干露導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng),并對機(jī)體造成了氧化損傷[25].由于ROS 能夠抑制DNA 聚合酶活性并阻礙DNA 修復(fù),進(jìn)而可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12],而細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡,在清除受損和壞死細(xì)胞以及維持動(dòng)態(tài)平衡方面起著至關(guān)重要的作用[26].Bcl-2 和BAX 蛋白是調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的Bcl-2 蛋白家族的成員,Bcl-2 蛋白可以預(yù)防細(xì)胞凋亡,而BAX 蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27].在蛋白水平上,BAX/Bcl-2的比值大于1,代表線粒體途徑被激活,細(xì)胞發(fā)生凋亡[28].本研究中擬穴青蟹的bax/bcl-2比值在17 ℃和33 ℃干露脅迫24 h 時(shí)均大于1,同時(shí)其caspase-3基因表達(dá)量也達(dá)到頂峰,表明此時(shí)細(xì)胞凋亡可能處于較高水平.

4 結(jié)論

本文探究了不同干露溫度對擬穴青蟹幼蟹存活、血藍(lán)蛋白水平、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溫度下的干露均導(dǎo)致擬穴青蟹氧化應(yīng)激、皮質(zhì)醇水平上升,以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化,且溫度和干露具有交互作用.高溫和干露脅迫可能通過氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡途徑降低擬穴青蟹存活表現(xiàn),17 ℃是擬穴青蟹幼蟹最適宜的運(yùn)輸溫度.