益氣養陰方聯合電針對產后壓力性尿失禁大鼠CXCR4/COX-2 信號通路的影響?

徐 靜，王 旭，房桂英，黃麗霞，魏旭靜

河北醫科大學第一醫院婦產科，河北 石家莊 050051

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指在打噴嚏、咳嗽等運動時，腹部壓力增高而出現的尿液不自主經尿道外口漏出的現象［1］。產后壓力性尿失禁（postpartum urinary incontinence，PPUI）是指在妊娠和分娩后，產婦出現的SUI 現象，PPUI 在產婦中的發病率達60%以上，給產婦的身心健康和生活質量帶來嚴重影響［2］。SUI的發病機制較為復雜，有研究發現妊娠生理期會增加腹部壓力，減少盆底支持結構膠原，同時分娩會損傷產婦盆底神經、肌肉和筋膜，導致盆底支持組織松弛，進而導致SUI［3］。目前臨床治療SUI 多采用無張力吊束帶，此方法僅為物理作用，無組織結構和功能方面的根本改善，不能恢復骨盆肌肉和尿道肌肉收縮強度，效果不理想［4］。近年中醫藥輔助治療SUI效果已得到證實［5］，但益氣養陰方治療SUI 的研究尚未見報道。中醫臨床常用針灸治療SUI療效較好［6］。有文獻證實，電針可有效降低SUI患者漏尿量，漏尿患者可從64.4%降低至14.4%以下［7］。環氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）是COX-2的亞型之一，多在核膜和微粒體膜中表達［8］。炎癥反應時機體COX-2高表達。有研究發現COX-2存在于多種組織中，例如生殖系統、腸胃、尿道組織等，有調控人體下尿路的功能［9］。基質細胞衍生因子（stromal cell derived factor-1，SDF-1）及其趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）構成了SDF-1/CXCR4 軸，對干細胞歸巢有一定調控作用［10］。CXCR4 在多種組織細胞中均有表達，但CXCR4 在膀胱和尿道組織中的表達尚不明確。本研究旨在探究益氣養陰方聯合電針對PPUI 大鼠CXCR4/COX-2信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級大鼠150 只，120 只為雌性未生產大鼠，30 只為雄性大鼠；大鼠體質量為220～240 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002。普通飼料喂養大鼠7天以適應新環境，室溫保持在25 ℃左右，室內光照仿晝夜交替，12 h 一循環，自由進食攝水。

1.2 試劑與儀器上海中醫藥大學中藥制劑室調制的益氣養陰方，主要由黨參15 g，玄參15 g，黃芪20 g，天花粉20 g，熟地黃10 g，炒山藥10 g，覆盆子10 g，麥冬10 g，知母10 g，肉桂2 g，鹿茸3 g 組成，將藥材分別加水煎煮2 次，第1 次加入10～12 倍水，煎煮1～2 h，第2 次加入8～10 倍水，煎煮1～1.5 h，合并2次水煎液，沉淀24 h，濾過，收集濾液；CXCR4抗體和COX-2抗體（購自中國Abcam，貨號：ab309219、ab88522）；中性樹膠（購自上海博湖生物科技有限公司，貨號：S30509，規格：100 g）；YD-6LA 切片包埋機購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司。

1.3 動物分組與模型制備將120 只雌性大鼠和30只雄性大鼠按照4∶1合籠，1個月后120只雌性大鼠均臨產，將120 只臨產大鼠分為空白組20只，模型組100 只。大鼠分娩后1 天，將100 只大鼠用烏拉坦腹腔麻醉，仰臥位固定，在大鼠陰道內插入8Fr弗萊氏尿管，深度為2～3 cm，將5 mL 生理鹽水注入氣囊中，予平行陰道徑向壓力300 g，8 h后，將水囊導尿管從陰道中取出，制備PPUI 模型。空白組為正常生產大鼠，不予任何處理。

1.4 動物模型鑒定

1.4.1 噴嚏實驗 在大鼠膀胱中插入硬膜外導管，并將含美藍的生理鹽水注入到膀胱內，當看到尿道外口有藍色液體漏出時記錄大鼠最大膀胱容量，排空膀胱，將最大膀胱量一半的美藍生理鹽水再次注入膀胱內；剪下大鼠鼠須，將其伸入到大鼠鼻孔內制造大鼠噴嚏反應，當大鼠尿道口有藍色液體流出時記為噴嚏實驗陽性；當大鼠尿道口沒有藍色液體流出時記為噴嚏實驗陰性，統計大鼠噴嚏實驗陽性數量。

1.4.2 尿動力學檢測 將導管插入各組大鼠膀胱內，用尿動力學檢測儀測定各組大鼠尿動力。各組大鼠排空膀胱，將含美藍的生理鹽水用微量泵注入膀胱內，速度保持在每小時10 mL，記錄尿道口出現第一滴尿液的時間與此時的膀胱內壓力。最大膀胱容量=10 mL/h×時間，此時膀胱內壓力為漏尿點壓力，重復3次，取平均值。

1.5 動物分組與藥物干預造模成功大鼠共計75只，按隨機數字表法分為PPUI組、益氣養陰組、益氣養陰+電針組，每組25 只。益氣養陰組大鼠灌胃1 mL/100 g益氣養陰湯劑，連續8周；益氣養陰+電針組大鼠灌胃1 mL/100 g 益氣養陰方湯劑后給予無菌針灸針直刺大鼠雙側腎俞穴15 mm，斜刺入會陽穴20 mm，將電子診療儀和雙側針柄相連接，電壓3.6 V，頻率1 Hz，波長20 ms，串長2 s，每周電刺激2 次，共8 周。其中空白組和PPUI 組大鼠僅灌胃等量生理鹽水，共8周。

1.6 盆底肌肉肌力檢測測定各組大鼠建模后1 天及1、2、4、8 周時的單收縮最大肌張力。固定各組大鼠，游離恥尾肌體部，保證大鼠供血完整。切斷大鼠恥尾肌肌腱，用腸線將肌腱和張力換能器相連接，連接線始終處于水平狀態。用鉑金雙極刺激電極直接刺激支配神經，刺激位置為距離入肌點2 mm 處，調整肌肉最適初長度和閾上刺激電壓，記錄單收縮最大肌張力。測試后稱量恥尾肌重量，計算各組盆底恥尾肌單刺激收縮力與肌重比值。

1.7 血清生化檢測建模8周后，取各組大鼠眼底血管內全血8 mL，將全血靜止1 h，離心半徑10 cm，8000 r/min 離心10～15 cm，去上清，用全自動生化分析儀檢測血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）與肌酸激酶（creatine kinase，CK）含量。

1.8 肛提肌組織病理學變化處死各組大鼠，取盆底兩側恥尾肌組織制成石蠟切片，用伊紅-蘇木染色，將切片組織經脫水、透明后用中性樹膠封片，用顯微鏡觀察盆底恥尾肌病理變化。

1.9 尿道組織CXCR4、COX-2 蛋白檢測（蛋白印跡法）每組取大鼠5 只，取尿道組織，用眼科剪剪碎后提取總蛋白。先制備SDS 聚丙烯酰胺凝膠，在孔板的每個孔內分別加入50 μg蛋白樣品，加壓跑電泳，當孔板底部鋪滿蛋白樣品時停止加壓，1 h內將蛋白樣品全部轉移到PVDF膜上，用脫脂奶粉室溫封閉蛋白樣品2 h；用加入一抗浸泡蛋白樣品，4 ℃環境孵育過夜，清洗蛋白后用發光顯色液對蛋白樣品顯色。

1.10 統計學方法采用SPSS 15.0 軟件分析數據，計量資料以xˉ±s表示，用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型鑒定與尿動力學測定造模結果顯示共有75 只大鼠噴嚏實驗呈陽性，且尿動力出現異常，模型制備成功，成功率為75%。與空白組相比，最大膀胱容量和漏尿壓力點PPUI組均降低（P＜0.05），益氣養陰組和益氣養陰+電針組升高，益氣養陰+電針組升高效果更明顯（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠尿動力學指標比較（xˉ±s）

2.2 大鼠盆底肌肉肌力比較干預1 天時，PPUI組、益氣養陰組和益氣養陰+電針組大鼠收縮力/肌力比值無顯著變化（P＞0.05）；與空白組相比，在干預2、4 和8 周時大鼠收縮力/肌重比值PPUI組降低（P＜0.05），益氣養陰組和益氣養陰+電針組較PPUI 組增加，且益氣養陰+電針組增加更明顯（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠盆底肌肉收縮力/肌重比值比較（xˉ±s）

2.3 大鼠血清生化指標比較LDH、CK 含量PPUI組較空白組升高（P＜0.05），益氣養陰組和益氣養陰+電針組較PPUI 組降低（P＜0.05），且益氣養陰+電針組降低更明顯（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠LDH、CK含量比較（xˉ±s） U/L

2.4 大鼠肛提肌組織病理學變化與空白組相比，PPUI 組大鼠肛提肌較肥大，肌纖維組織排列不規則，部分細胞橫街面積不一致，有萎縮細胞、肥大細胞出現，肌纖維大量壞死；與PPUI 組相比，益氣養陰組和益氣養陰+電針組大鼠肌纖維組織改善明顯，肛提肌纖維排列較緊密，肌纖維僅有少量壞死，無變性；益氣養陰+電針組大鼠肛提肌組織較益氣養陰組改善較顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠肛提肌組織病理學變化（HE，×400）

2.5 大鼠尿道組織CXCR4、COX-2 蛋白表達與空白組相比，PPUI 組CXCR4 蛋白減少，COX-2 蛋白增多（P＜0.05）；益氣養陰組和益氣養陰+電針組CXCR4 蛋白較PPUI 組增多，COX-2 蛋白較PPUI 組減少（P＜0.05）；且益氣養陰+電針組CXCR4 蛋白表達高于益氣養陰組，COX-2 蛋白低于益氣養陰組（P＜0.05），見圖2—3。

圖2 各組大鼠尿道組織中CXCR4、COX-2蛋白表達

圖3 各組大鼠尿道組織中CXCR4、COX-2蛋白表達柱狀圖

3 討論

有研究顯示，90%以上的SUI 屬解剖型尿失禁，主要為盆底肌松弛所致，一般在妊娠后陰道分娩時發生損傷，以及絕經后雌雄激素水平降低等導致［11］。盆底支持結構損傷，導致膀胱近端尿道從盆底脫出，咳嗽時腹腔內壓力不能均勻傳遞到膀胱和近端尿道，膀胱內壓力大于尿道內壓力，導致漏尿［12］。美國泌尿學會研究發現，手術治療對多數SUI 長期有效，但手術會給患者帶來創傷，并且術后會發生尿急、尿困難等風險［13］。有專家建議，輕度和中度尿失禁患者首選非手術治療［14］。藥物治療SUI 不僅可減輕漏尿次數，還可提高患者生活質量，目前常用的藥物有α1腎上腺素受體激動劑米多君等，不僅費用高，用藥后會出現較多不良反應，患者難以接受［15］。中醫將其歸為“小便不盡”“遺尿”等范圍，多為腎氣虛弱，膀胱不固，治療應補腎固攝。中醫學認為盆腔器官脫落為“陰挺”，主要發病機制為氣虛下陷，治療應益氣升提，補中固脫。產婦生產后一般氣血虧虛，腎氣不固，膀胱失約，進而導致遺尿，治療應培補腎氣、固攝膀胱［16］。根據“經脈所過，主治所及”理論，經絡穴位可治療經絡循行部位病證，因此本研究取鼠雙側腎俞穴和會陽穴。本研究發現PPUI 組大鼠最大膀胱容量和漏尿點壓力降低，益氣養陰+電針組升高。有研究［17］證實，PPUI 組大鼠最大膀胱容量和腹壓漏尿點壓力降低，益氣養陰+電針組提升，與本研究結果一致。

女性生理性控尿由尿道括約肌和骨骼肌的自主收縮完成，進而對盆腔內臟器提供長久支持。當肛提肌發生損傷，腹部壓力突然升高，膀胱壓力超過尿道壓力，進而導致壓力性漏尿［18］。本研究中PPUI 組大鼠收縮力/肌力比值降低，益氣養陰+電針組高于PPUI 組。尿失禁發生時肌肉收縮功能下降，可見益氣養陰+電針對產后尿失禁有明顯改善作用，益氣養陰+電針可通過增加盆底肌肌肉收縮功能起改善主動控尿的作用機制。肌肉發生損傷時，血清LDH 和CK 會發生一定變化。本研究結果顯示，PPUI 組大鼠血清LDH 和CK 含量高于空白組，可見受長期壓力作用，損傷大鼠盆底肌肉群，增加膜的通透性，進而外漏了部分胞內酶；益氣養陰+電針組血清LDH 和CK 含量被抑制。益氣養陰方中黨參和黃芪補中益氣；肉桂和麥冬養陰生津；覆盆子和雞內金健脾利濕，收澀縮脲；鹿茸補腎助陽，能有效增強腎臟利尿功能。關元俞補腎益氣，電刺激可增加其療效，腎氣充足，膀胱開闔有度，進而抑制尿液外溢［19］。可見益氣養陰方聯合電針干預治療PPUI療效確切。

有學者對犬類動物研究發現，COX-2 在下尿路中表達，并且催化COX-2產生的PGs產物在下尿路中的分布和性腺狀態密切相關［20］。切除動物性腺后，COX-2 在下尿路中呈低表達，進而損傷下尿路功能，可見性腺切除會導致動物尿失禁。CXCR4是SDF-1 趨化因子的特異性受體，研究證實干細胞表面的CXCR4 表達會通過多種因子刺激而增加，進而增加干細胞的歸巢能力。本研究結果顯示，PPUI組CXCR4蛋白減少，COX-2蛋白增多；益氣養陰+電針組CXCR4 蛋白較PPUI 組增多，COX-2 蛋白較PPUI 組減少，可見益氣養陰方加電針可降低COX-2表達，增加CXCR4表達，進而對CXCR4/COX-2蛋白表達進行有效調控。LENIS 等［21］研究證實，未生產過的大鼠陰道擴張7 天后，CD193 和CXCR4表達上調，與本研究結果一致。

綜上所述，益氣養陰方聯合電針可提高產后大鼠壓力性尿失禁療效，增加CXCR4 表達，抑制COX-2表達。