基于整合藥理學平臺的當歸補血湯治療貧血分子作用機制研究?

侯敏娜，侯少平，逯 莉，王飛娟，許海燕，劉艷紅

陜西國際商貿(mào)學院，陜西 咸陽 712046

當歸補血湯是金元時期李東垣創(chuàng)制的益氣補血方劑，載于《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪、當歸（5∶1）組成［1-2］，是國家中醫(yī)藥管理局2018 年4 月公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》100 首方劑中的第51 首。該方可用于治療消化系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及腫瘤等引起的貧血［3-6］，其可通過加強鐵吸收、刺激腎臟促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）產(chǎn)生促進造血；亦促使減少抵抗免疫介導血細胞數(shù)量、促進骨髓集落細胞生長，以增重骨髓造血祖細胞［7］。目前當歸補血湯造血機制已明確，但由于其治療貧血作用機制的復(fù)雜性、多樣性，故仍是當今研究的熱點。

中醫(yī)藥整合藥理學平臺（integrative pharmacology-based research platform of traditional Chinese medicine，TCMIP）V2.0 為集中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)庫與整合藥理學計算于一體的智能化數(shù)據(jù)平臺，以多層次、多靶點及中西醫(yī)結(jié)合的思維方式，從“中藥-方劑-成分-靶標-通路-疾病”的多維關(guān)系整合研究中藥（復(fù)方）分子作用機制［8-9］，以克服以往研究中藥成分與體內(nèi)代謝及藥效間關(guān)聯(lián)度低的問題。基于此，本研究可為該方治療貧血的物質(zhì)基礎(chǔ)及臨床廣泛、合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 疾病靶標來源在TCMIP V2.0平臺中疾病靶標數(shù)據(jù)庫模塊下輸入貧血疾病的英文名“Anemia”，構(gòu)建當歸補血湯治療貧血的靶標數(shù)據(jù)庫。

1.2 方劑靶標來源在TCMIP V2.0 平臺“中藥（含方劑）靶標預(yù)測及功能分析”模塊下，勾選當歸補血湯組方的“黃芪”“當歸”中藥材，構(gòu)建該方的化學成分庫，再選擇平臺默認的相似性分數(shù)≥0.8的藥物對應(yīng)的靶標，獲得當歸補血湯分子作用靶標。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析在TCMIP V2.0 平臺“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊下，構(gòu)建“疾病（Anemia）-方劑（DBT）”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)；選擇“方劑-中藥材-化學成分-核心靶標-通路-疾病”關(guān)聯(lián)性節(jié)點，構(gòu)建可視化中藥多維網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 當歸補血湯治療貧血的核心靶標網(wǎng)絡(luò)與當歸補血湯及貧血疾病相關(guān)的核心網(wǎng)絡(luò)靶標共176個，其中疾病靶標157個，藥物靶標19個，二者共有靶標9 個；同時滿足大于節(jié)點連接度值（degree）、節(jié)點緊密度（closeness）、節(jié)點介度（betweenness）中位數(shù)卡值的核心靶標66 個。并且，對發(fā)揮協(xié)同作用的多種靶標進行排序，獲得前20 位的核心靶標。見圖1及附表1。

附表1 當歸補血湯治療貧血排名前20的核心靶標

圖1 當歸補血湯治療貧血核心靶標網(wǎng)絡(luò)圖

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，在排列前20 的關(guān)鍵核心靶標中，大多與癌癥發(fā)生有關(guān)，說明當歸補血湯可用于治療癌性貧血。如原癌基因：Akt1、CCND1、ABL1、KIT 在細胞增殖、分化、凋亡等過程中起決定作用，其功能異常表達即為癌性基因。王秋爽等［10］研究發(fā)現(xiàn)CCND1 表達異常在胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等腫瘤細胞侵襲和遷移過程中發(fā)揮作用；趙亮等［11］研究ABL1 相關(guān)融合基因與急性淋巴細胞性白血病有一定關(guān)系。這與當歸補血湯在血液疾病、心血管疾病、腫瘤疾病等如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病所致貧血的現(xiàn)代藥理學研究一致［4-6］。轉(zhuǎn)錄因子：如TFRC、TF、GATA1、EPOR、SMAD4、NFKB1 中TF 和TFR 直接與缺鐵性貧血中的鐵相關(guān)，TF、TFR可有效結(jié)合維持鐵的代謝，并調(diào)節(jié)正常細胞生長及其腫瘤細胞代謝［12］；GATA1是一種轉(zhuǎn)錄因子，對紅細胞分化有重要調(diào)控作用，研究表明GATA1 在腫瘤產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用［13］；EPOR 為Ⅰ型細胞因子受體，在許多腫瘤組織中表達，并與腫瘤侵襲性、血管生成及預(yù)后有關(guān)［14-15］；而SMAD4 與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，共同調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄，功能異常時參與腫瘤形成；NFKB1 核因子在炎癥反應(yīng)、固有免疫和適應(yīng)性免疫的發(fā)育、細胞生長和凋亡等過程中起重要作用，該因子功能與貧血所致的免疫力密切相關(guān)［16］。HSP90AA1 在細胞保護、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)等方面有重要作用［17-18］；CALM1、ESR基因在細胞分化、增殖和骨骼形成中起重要作用［19］；NDUFV1、NDUFS1 基因異常表達常與兒童遺傳性腦白質(zhì)疾病形成相關(guān)。SHMT2、SHMT1、AR、CASP3 在腫瘤細胞表達、增殖及神經(jīng)管畸形、糖尿病并發(fā)癥、高脂血癥［20］等方面有一定作用。

綜上所述，當歸補血湯可通過提高免疫力、消除炎癥、抑制骨質(zhì)疏松等途徑治療癌性貧血（如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病等）、缺鐵性貧血、腦質(zhì)供血不足和糖尿病并發(fā)癥、高脂血癥等所致貧血。

2.2 當歸補血湯治療貧血的GO 及KEGG 富集分析通過GO分析，當歸補血湯治療貧血涉及主要條目有：缺鐵性貧血信號通路（紅細胞分化、促紅細胞生成素介導信號通路、對鐵離子反應(yīng)、細胞鐵離子穩(wěn)態(tài)）；腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、代謝（細胞增殖正調(diào)節(jié)、細胞增長負調(diào)節(jié)、蛋白激酶b 信號蛋白正調(diào)節(jié)、細胞分化）；蛋白酶免疫調(diào)節(jié)通路（肽絲氨酸磷酸化正調(diào)節(jié)、Nf-kappab 轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)節(jié)、對氧化應(yīng)激的回應(yīng)、氧化還原法、活性氧類代謝過程）；影響激素發(fā)育通路（雄性性腺發(fā)育、乳腺腺泡發(fā)育）；炎性貧血關(guān)聯(lián)通路（細胞因子介導的信號通路、Nf-kappab 轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)節(jié)）以及骨吸收積極調(diào)節(jié)、營養(yǎng)不良性貧血通路（線粒體呼吸鏈組裝和電子傳遞從nadh 到泛醌等細胞組分）。預(yù)示本方可通過增強免疫力、抗炎、促紅細胞生成、抑制不良細胞增殖和分化及促凋亡等途徑，以治療白血病、癌癥、糖尿病并發(fā)癥、缺鐵性貧血、營養(yǎng)不良及炎癥等疾病引起的貧血。根據(jù)P值顯示，前20個GO條目見表1。

通過KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，其中涉及到癌癥相關(guān)通路8 條：腫瘤壞死因子受體超家族（tnfsf）介導非典型的nf-k、葉酸和蝶呤的代謝、四氫生物蝶呤（bh4）合成、VEGFR2 介導的通透性、激酶對raf 信號的反常激活、中等激酶活性的信號傳導braf 突變體、Pip3 激活A(yù)kt 信號、Pi5p pp2a 和ier3 規(guī)范pi3k/Akt，均在癌細胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用；與免疫系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)等有重要作用的4 條通路，包括IL-4、IL-13、IL-7 和細胞內(nèi)受體趨化作用；涉及血小板相關(guān)4 條通路包括轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞和再循環(huán)、整合素alphaiib beta3 信號、血小板脫顆粒、鐵的吸收和運輸；此外，還有復(fù)合物i 生物發(fā)生、呼吸電子傳遞，雌激素依賴性基因表達，伊諾斯激活和葉酸的代謝等通路。KEGG 富集結(jié)果顯示當歸補血湯可用于治療白血病、癌癥、糖尿病并發(fā)癥、炎癥、缺鐵性及營養(yǎng)不良等疾病誘發(fā)的貧血。見表2。

2.3 當歸補血湯治療貧血的“方劑-中藥-成分-疾病-靶標-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析由DBT 與貧血靶標的PPI 網(wǎng)絡(luò)信息，構(gòu)建該方治療貧血的“方劑-中藥-成分-疾病-靶標-通路”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，見附圖1。提示當歸補血湯通過多層次、多靶點、多環(huán)節(jié)等途徑治療貧血。

附圖1 當歸補血湯治療貧血多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

圖中黃色菱形為化學成分，當歸中5 種成分豆甾醇、琥珀酸、葉酸、癸二酸、壬二酸和黃芪中3種成分谷甾醇、葉酸、華良姜素，主要通過提高免疫力、改善營養(yǎng)、抗腫瘤、降低血液膽固醇、抗炎、抗氧化、減輕或消除動脈粥樣硬化、改善糖尿病胰島分泌、缺血再灌注等途徑治療貧血［21-22］。灰色靶標主要富集在線粒體復(fù)合物i 生物發(fā)生與呼吸電子傳遞相關(guān)通路，通過能量傳遞對心肌缺血、再生障礙性貧血有改善作用［23］。

紫色靶標主要富集在葉酸和蝶呤的代謝相關(guān)通路，通過提高免疫力、減少炎癥，對糖尿病致血管疾病、放射性肺炎、肺纖維化、抑制腫瘤細胞生長等發(fā)揮重要作用［24-25］；藍色靶標主要與伊諾斯激活、VEGFR2介導的通透性、IL-4和IL-13信號通路、雌激素依賴性基因表達和四氫生物蝶呤合成、回收、打撈、調(diào)節(jié)和管理通路相關(guān)，通過抑制血管新生過度或血管新生缺陷（如金永志等［26］研究當歸補血湯促進VEGF 在血管新生和相關(guān)細胞的動員等方面起重要作用）、心肌細胞缺血、雌激素依賴、抗氧化和清除活性氮氧化物等作用，在子宮內(nèi)膜癌、子宮肌瘤、乳腺癌、霍奇金淋巴瘤細胞、慢性B淋巴細胞白血病、骨癌細胞等［24，27］惡性腫瘤及風濕病、糖尿病和缺血性心血管疾病等［28］的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；淺綠色靶標主要與鐵吸收和運輸、轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞和再循環(huán)、血小板脫顆粒，IL-7信號傳導、網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞識別通路相關(guān)，通過參與5-羥色胺、細胞因子、組織胺等活性物質(zhì)的炎癥反應(yīng)，刺激一些良性和惡性淋巴細胞群、誘導鐵調(diào)素增多、抑制病毒感染等途徑，對慢性炎癥性貧血、腫瘤（T 細胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤等）及免疫力低下、缺鐵、B-地中海貧血及幼年血色病等［29］引起的貧血有一定作用。墨綠色靶標主要與Tnfr2非正規(guī)NF-κB通路、細胞外間質(zhì)退化、膠原降解、刺激感覺通道和MHC 第二類抗原呈現(xiàn)通路相關(guān)，通過抑制腦部缺血、炎癥反應(yīng)、提高自身免疫力等途徑，對黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、前列腺癌，特別是霍奇金淋巴瘤、膠質(zhì)瘤和非小細胞肺癌，腦缺血等引起的貧血有重要作用。

從當歸補血湯治療貧血的“方劑-中藥-成分-疾病-靶標-通路”分析，預(yù)知其通過提高免疫力、消除或減少炎癥、改善營養(yǎng)、抗氧化等途徑，對心腦缺血、缺鐵性貧血、慢性炎癥性貧血、癌性貧血（白血病、骨癌、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤、肺癌等）、糖尿病并發(fā)癥及高脂血癥等引起的貧血有治療作用。

3 結(jié)論

當歸補血湯方中重用黃芪大補脾肺之氣；臣以當歸補益心肝之血，且能活血，具有補而不滯的特點。方中大量黃芪補氣生血，與當歸共奏益氣、養(yǎng)血、活血之效。可用于氣血不足引起的面色萎黃、頭暈心悸、神疲、氣短、乏力等癥。當歸補血湯臨床常用于內(nèi)科疾病（如白細胞減少癥、貧血、白血病、隱形失血、糖尿病并發(fā)癥、骨髓抑制、肝炎、肝纖維化等）、外骨科疾病（骨折及術(shù)后并發(fā)癥、術(shù)后血虛發(fā)熱及感染等）、婦科疾病（功能失調(diào)性子宮出血、婦科術(shù)后發(fā)熱、先兆流產(chǎn)等）、兒科疾病（早產(chǎn)兒貧血、兒童缺鐵性貧血）等。

本研究借助TCMIP V2.0 平臺，分析當歸補血湯治療貧血的分子作用機制，結(jié)果顯示，黃芪中3種成分谷甾醇、葉酸、華良姜素和當歸中5 種成分豆甾醇、琥珀酸、葉酸、癸二酸、壬二酸，可通過提高免疫力、改善營養(yǎng)、抗腫瘤、降低血液膽固醇、抗炎、減輕或消除動脈粥樣硬化等途徑治療癌性貧血、營養(yǎng)不良性貧血、炎性貧血、缺鐵性貧血等。從排列前20位核心靶標中發(fā)現(xiàn)Akt1、CCND1、ABL1、EPOR、GATA1、SMAD4 等大多與癌性貧血發(fā)生有關(guān)，其可能通過細胞增殖正調(diào)節(jié)、細胞增長負調(diào)節(jié)、蛋白激酶b 信號蛋白正調(diào)節(jié)、細胞分化等相關(guān)通路起到抑制癌細胞增生、增長、分化及促凋亡等作用；而NFKB1、HSP90AA1、TFRC、TF、NDUFV1、NDUFS1等靶標可能通過細胞因子介導的信號通路、Nfkappab 轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)節(jié)、線粒體呼吸鏈組裝、紅細胞分化、促紅細胞生成素介導信號通路、肽絲氨酸磷酸化正調(diào)節(jié)等途徑提高機體免疫力、補充營養(yǎng)、消除炎癥等，以治療缺鐵性貧血、炎性貧血、心腦缺血、糖尿病并發(fā)癥及營養(yǎng)不良性貧血等疾病，這與該方現(xiàn)代藥理學研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果可為當歸補血湯的臨床應(yīng)用及進一步開發(fā)提供依據(jù)。