基于網絡藥理學的海桐皮治療類風濕關節炎機制研究?

羅業浩，唐秀松，許棟涵，龐宇舟，李仁鋒

1 廣西中醫藥大學/壯醫方藥基礎與應用研究重點實驗室，廣西 南寧 530200；

2 澳門科技大學中醫藥學院，澳門特別行政區 999078；

3 廣西中醫藥大學/壯瑤藥工程技術研究中心，廣西 南寧 530200；

4 廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種難治性免疫性疾病，臨床主要表現為侵蝕性、對稱性多關節炎損害［1-2］。流行病學資料顯示，RA的發病率女性和男性分別在70～74 歲和75～79歲年齡組最高，男女比例為1∶4，我國患病率為0.32%～0.36%［3］。RA 發生發展的生物過程復雜，確切的發病機制尚不清楚，認為主要與遺傳因素、生活環境、細菌及病毒感染有關［4］。西醫針對RA的治療主要包括非甾體類抗炎藥、生物制劑及糖皮質激素等。中醫近年來在RA 的治療中發揮了重要作用，中醫認為RA 屬“痹癥”范疇，其主要病機是“外邪侵襲肢體，經絡閉阻，不通則痛”，治療以“驅邪通絡”為主［5］，多使用具有祛風除濕功效的藥物，這些藥物對緩解患者疼痛、改善患者生活質量、延緩病情進展等有重要作用，但具體作用機制尚不明確，而網絡藥理學為分析藥物與疾病關聯性的有效工具，故本研究應用網絡藥理學方法探索藥物與疾病之間的相互作用機制，有助于更好地了解藥物發揮治療作用的機理。

海桐皮Aralia chinensisL.又名鵲不踏、鳥不宿等，為豆科植物刺桐的干皮，為常用的中草藥，性溫，味微咸，入肝、心、腎3 經，具有鎮痛消炎、祛風行氣、祛濕活血之效，是治療風濕痹痛的關鍵藥物之一，為臨床常用藥物［6］。

網絡藥理學［7-8］是一門新興學科，其原理是基于系統生物學和生物網絡平衡闡釋疾病發生發展過程、從改善或恢復生物網絡平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導發現新藥。本研究基于大數據平臺及計算機技術，結合網絡藥理學原理，探討海桐皮治療RA 的可能作用靶點及通路，為中藥挖掘提供思路。

1 研究方法

1.1 海桐皮藥物有效成分及相關靶點收集以“海桐皮”為關鍵詞在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform ，TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中進行檢索，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 進行篩選，最終得到海桐皮的有效成分。導出海桐皮藥物相關靶點，最終得到海桐皮相關靶點數據。

1.2 RA 疾病數據收集以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞分別在人類基因數據庫（the human gene database，GeneCards）、Disgenet 數據庫進行查找，物種來源選擇“Homo sapiens”，下載保存合并數據后去除重復基因，最終獲得RA 的相關疾病基因。

1.3 海桐皮相關靶點基因注釋運用Perl腳本，以uniprot 蛋白數據庫為參照進行海桐皮藥物相關靶點基因注釋，得到海桐皮相關藥物靶點基因。

1.4 海桐皮- RA 交集基因運用R 軟件中的Venn Diagrams 程序包取RA 疾病基因和海桐皮藥物相關靶點基因的交集基因，繪制韋恩圖。

1.5 藥物-疾病作用網絡構建將藥物-疾病交集基因運用perl腳本進行映射，獲得藥物-疾病之間相互作用的有效成分及相關基因靶點，隨后將所得有效成分及相關基因靶點數據導入Cytoscape 3.7.1 軟件進行可視化網絡構建，展現藥物-有效成分-基因靶點-疾病網絡。

1.6 海桐皮- RA 蛋白互作網絡構建利用在線String網站（https：//string-db.org/）對藥物-疾病交集基因進行藥物-疾病之間蛋白相互作用網絡構建，篩選標準：檢測物種選擇人（Homo sapiens），置信值（medium confidence）取0.04，去除網絡中離散或無關聯的蛋白，最終得出海桐皮-RA 相互作用蛋白網絡圖。

1.7 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）利用R 軟件中的RSQLite、BiocManager、org.Hs.eg.db程序包處理所得交集基因，獲得交集基因的ID，將獲得的基因ID 再運用R 軟件中的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview 程序包進行GO 生物過程富集分析及KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 海桐皮有效成分最終獲得海桐皮有效成分6個，見表1。

2.2 海桐皮相關靶點基因注釋結果將海桐皮225 個相關靶點以Uniprot 數據庫作為篩選庫，對海桐皮相關靶點基因進行注釋，最終得到46 個藥物相關靶點基因，主要包括PTGS1、NOS2、MAPK14、GSK3B、SLC6A3等。

2.3 RA 疾病基因在GeneCards 數據庫中找到RA 基因253 個，在Disgenet 數據庫找到RA 基因430個，去除重復基因，最后得到RA基因450個，這些基因主要有IL-6、HLA-DRB1、TNF、PTPN22、IL-10、STAT4、MIF、IL-2RA、IRF5、IL-1B、HLA-B等。

2.4 海桐皮藥物靶點基因與RA 疾病基因交集結果對“2.2”項所得46 個有關海桐皮藥物靶點基因與“2.3”項所得450 個RA 疾病基因運用R×64 3.5.3 軟件進行計算分析，結果得到14 個交集基因，分別為ADRA2B、ADRA1B、ADRB2、ADRA1D、NOS2、NR3C2、ADRA2A、SLC6A2、ADRB1、ADRA1A、ADRA2C、SLC6A4、DRD2、PPARG，繪制Venny圖，結果見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點基因Venny圖

2.5 藥物-疾病相互作用網絡將獲得的14 個交集基因運用Perl 腳本處理后導入Cytoscape 3.7.1 軟件進行可視化網絡構建，展現藥物、疾病、基因、分子相互作用網絡，見圖2。

圖2 海桐皮主要活性成分-靶點-藥物-疾病網絡

2.6 海桐皮-RA蛋白互作網絡最終得出的相應PPI網絡有13個節點，32條邊，平均每個節點的度為4.57，平均局部聚類系數為0.61，PPI enrichmentP＜1.0e-16，見圖3。

圖3 交集基因PPI網絡圖

2.7 海桐皮-RA 蛋白互作網絡核心蛋白在海桐皮-RA 蛋白相互作用網絡中，下載其string_interactions文件，并以tsv格式保存，運用R×64 3.5.3 軟件繪制海桐皮在該網絡中核心蛋白條形圖，結果顯示ALB、IL-6、NOS3、VEGFA、FOS 等在該網絡中起關鍵作用，見圖4。

圖4 PPI網絡核心蛋白條形圖

2.8 GO與KEGG將所得14個交集基因導入R×64 3.5.3 軟件進行GO 生物過程富集分析和KEGG 通路分析，結果顯示海桐皮治療RA 的主要生物過程包括了腎上腺素受體活性、G 蛋白偶聯的胺受體活性、兒茶酚胺結合、腎上腺素受體結合等過程，KEGG信號通路富集分析顯示主要涉及的信號通路包括了cGMP-PKG信號通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路及cAMP等信號通路等。GO分析結果見圖5，KEGG通路富集分析見圖6—8及表2。

圖5 GO富集分析條形圖

圖6 KEGG富集分析條形圖

圖7 cGMP-PKG信號通路圖

3 討論

RA 是一種慢性自身免疫性疾病，其特征性表現主要是進行性、對稱性、多滑膜關節炎和關節外表現，最終導致關節畸形、功能障礙，嚴重影響患者生活質量［9］。對于RA 的發病機制，目前研究認為其主要與免疫紊亂、細胞因子網絡、遺傳因素及環境因素等有關［10-14］。在分子機制方面，認為多種細胞因子如IL-B12、微小RNA（microRNAs，miRNA）、基因多態性及信號傳導通路在RA 的滑膜和骨質破壞過程中發揮作用［15-21］。近年來，中醫藥在治療RA 中發揮重要作用，中藥對降低促炎性細胞因子產生及減輕患者疼痛與炎癥反應有重要作用，對RA 具有治療作用［22-24］。海桐皮是臨床常用于治療風濕痹痛的有效藥物，海桐皮中含有刺桐靈堿、氨基酸和有機酸等，由海桐皮組成的海桐皮湯化裁常用于治療骨關節炎、骨折等，對骨關節修復具有重要作用［25-27］。

本研究通過TCMSP 篩選得到海桐皮有效成分6 個，分別為赤蘚堿（Erythraline）、異巴巴膽（isobavachin）、豆甾醇（Stigmasterol）、赤蘚堿（Erysotrine）、菜豆蛋白（Phaseolin）、菜豆素（Phaseollidin）。其中赤蘚堿（Erythrina）屬的第一種化學物質在1930 年被報道，其中分離出類胡蘿卜素，一種螺環狀生物堿，顯示出咖喱樣活性［28］，赤蘚堿生物堿通過調節煙堿樣受體對中樞神經系統產生影響，其在中樞神經系統中具有重要生物活性，其對疼痛、焦慮、失眠有良好調控作用［29-30］，雖然目前未見其治療RA的報道，但其治療疼痛的特性可能緩解RA 疼痛。豆甾醇又名豆固醇、甾醇屬植物甾醇，具有較強的生理活性和表面活性，可抗炎、抗氧化、抗癌、降膽固醇等［31］，CHEN等［32］研究發現，豆甾醇能抑制基質金屬蛋白酶表達，抑制軟骨降解。Erysotrine屬赤蘚堿類，赤蘚堿的mulungu 提取物能降低IL-4 和IL-5 水平，提高IL-13和干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）水平，表明其對炎癥治療有一定潛在價值。異巴巴膽、菜豆蛋白、菜豆素目前尚未見相關報道，可為進一步研究海桐皮治療RA提供新方向。

此外，本研究發現了14個海桐皮與RA的交集基因，通過STRING數據庫得出海桐皮治療RA的核心蛋白包括ALB、IL-6、NOS3、VEGFA、FOS、PPARG、NR3C1、CRP 等20 個核心基因，其中ALB 基因編碼是人類血液中最豐富的蛋白質。該蛋白在調節血漿膠體滲透壓中起作用，并充當多種內源性分子（包括激素、脂肪酸和代謝產物）以及外源性藥物的載體蛋白。該蛋白還表現出廣泛底物特異性的酯酶樣活性。IL-6為在炎癥和B細胞成熟中起作用的細胞因子。另外，已證明編碼蛋白質是患有自身免疫性疾病或感染者發燒的內源熱原，該蛋白主要在急性和慢性炎癥部位產生，并通過IL-6受體α誘導轉錄炎癥反應。有研究表明，IL-6 與RA有密切關系，參與了RA 骨破環、炎癥反應等［33-34］。一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase，NOS3）是一種蛋白質編碼基因，在多種過程中充當生物介質，包括神經傳遞以及抗微生物和抗腫瘤活性。NOS3 基因參與了抑制血管內皮表面血小板和白細胞的黏附、聚集及血管平滑肌細胞增生［35］。同時，本研究發現，腎上腺素受體活性、G 蛋白偶聯的胺受體活性、兒茶酚胺結合等均參與了海桐皮治療RA 的過程，其中腎上腺受體作為聯系神經系統與免疫系統的重要受體，可能參與了對RA 的神經免疫調節，介導了RA 的炎癥反應過程及細胞凋亡過程［36-38］，G 蛋白偶聯的胺受體（G proteincoupled receptors，GPCRs）在免疫應答調節中起重要作用，GPCRs家族包括β2腎上腺素受體、趨化因子受體，其中趨化因子在RA 致炎機制中一方面通過迅速刺激依賴凝集素的T淋巴細胞黏附，趨化特定的細胞到炎癥部位，導致免疫細胞穿過血管到達關節，另一方面通過其他生物功能調節因子，包括淋巴細胞活化、分化以及酶和細胞因子的釋放、細胞毒作用及其他起作用［39-41］。兒茶酚胺被認為是神經細胞或內分泌細胞分泌的神經遞質或激素，有研究表明，RA的炎癥機制與免疫細胞中內源性兒茶酚胺的活性增強相關，并通過兒茶酚胺調控促炎性細胞或炎癥抑制細胞增殖與功能實現［42］。

cGMP-PKG 信號通路、神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP 信號通路等同樣參與了海桐皮治療RA等生物過程，其中cGMP-PKG信號通路是指環鳥苷酸/蛋白激酶G 信號通路［43］，其主要功能與平滑肌松弛，抑制非選擇性離子通道的Ca2+電導率有關。神經活性配體受體相互作用信號通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體，與環境信息處理、信號分子與相互作用有關［44］，鈣信號通路在細胞存活、增殖、代謝中發揮重要作用，其作用機理為Ca2+進入細胞內，激活各種Ca2+替代酶而產生作用［45-46］。研究發現，多種鈣通道對于破骨細胞的分化和功能必不可少，破骨細胞分化和功能的阻斷對抑制RA 骨破壞有效［47］。cAMP 信號通路又稱環磷酸腺苷信號通路，典型的cAMP 信號通路是由細胞外激動劑結合特異G 蛋白偶聯受體導致G 蛋白三聚體分解為G 蛋白α 亞單位和G 蛋白βγ亞單位，cAMP 與其調控亞單位結合釋放催化亞單位，催化亞單位進一步磷酸化位于胞質或胞核中的底物，包括酶、離子通道、染色體蛋白和轉錄因子等［48］。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學方法對海桐皮進行化學成分數據庫構建、靶點預測、藥物-靶點網絡構建和蛋白相互作用網絡分析GO生物過程和KEGG 通路富集分析，初步闡述了海桐皮治療RA的作用機制，但具體療效尚需進一步驗證。