芥菜型油菜苗期氮效率相關性狀全基因組關聯分析

曾健，王茹夢，龔盼，楊瀟，尹曉奇，李江鶴，陳世龍，姚蕾，宋海星，康雷，張振華

芥菜型油菜苗期氮效率相關性狀全基因組關聯分析

曾健1，王茹夢1，龔盼1，楊瀟1，尹曉奇1，李江鶴1，陳世龍1，姚蕾1，宋海星1，康雷2，張振華1

1湖南農業大學資源學院，長沙 410128；2湖南農業大學農學院，長沙 410128

【目的】通過對芥菜型油菜苗期氮效率相關性狀進行全基因組關聯分析，挖掘與油菜氮效率相關性狀顯著關聯的SNP位點，預測相關候選基因，為揭示油菜氮高效分子機制和創制氮高效種質提供理論依據。【方法】以153份芥菜型油菜品系作為關聯群體，設置低氮和正常氮2個處理，每個處理設置3個重復，并在2年（2021和2022年）進行2次完全重復的營養液培養試驗。計算植株根冠比和地上部氮含量的相對值（低氮/正常氮），以此作為氮效率相關性狀進行全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS），挖掘氮效率相關候選基因。【結果】芥菜型油菜氮效率相關性狀表現出豐富的變異，變異幅度為0.21—2.44，變異系數為22.92%—26.19%。全基因組關聯分析檢測到45個顯著關聯的SNP位點，其中，第一次根冠比相對值（relative root-shoot ratio 1，RRSR1）和第二次根冠比相對值（relative root-shoot ratio 2，RRSR2）共同關聯到的顯著SNP位點有16個，這些位點可解釋的表型變異率為10.69%—15.39%。第一次地上部相對氮含量（relative shoot nitrogen concentration 1，RSNC1）和第二次地上部相對氮含量（relative shoot nitrogen concentration 2，RSNC2）共同關聯到的顯著SNP位點共有29個，可解釋的表型變異率為13.22%—23.96%。在顯著SNP位點上下游200 kb范圍內共篩選出15個與氮效率相關候選基因，包括5個與硝酸鹽轉運相關的基因（、、、和）、3個與氮代謝相關的基因（、和）、4個與生長發育相關的基因（BjuCOBL8、、和BjuUP3）和3個與逆境響應相關的基因（BjuNTP7、BjuJUB1和BjuPYL6）。【結論】共檢測到45個與氮效率相關性狀顯著關聯的SNP位點，篩選出15個可能與芥菜型油菜氮效率相關的候選基因。

芥菜型油菜；氮效率相關性狀；全基因組關聯分析；候選基因

0 引言

【研究意義】氮（N）是植物生長所必需的“生命元素”。以氮肥為代表的化學肥料的施用是促進作物增產的關鍵因素之一。我國由于不合理或過量施用氮肥，氮肥平均利用率僅為30%左右，顯著低于發達國家[1-2]，也導致一系列的生態環境問題[3]，提高作物的氮素營養效率已成為我國實現農業綠色高效和可持續發展的迫切任務。芥菜型油菜具有耐貧瘠、抗（耐）病蟲害、抗裂角、抗倒伏等特點，它不僅在干旱地區具有種植優勢，還是進行油菜遺傳改良的寶貴資源[4-5]，探究其氮高效的分子遺傳機制，有利于為探索油菜氮肥利用率品種改良提供新的技術方法。【前人研究進展】植物吸收利用的兩大無機氮源為硝態氮和銨態氮，其中，硝態氮是旱地作物油菜根系吸收的主要氮素形態[6-7]。為了更有效地利用土壤中的硝態氮，植物在長期進化過程中形成了一套高效的硝酸鹽吸收轉運系統，分為高親和轉運系統（high-affinity transport system，HATS）和低親和轉運系統（low-affinity transport system，LATS）。其轉運能力受外界硝酸鹽濃度影響[8]，當硝酸鹽濃度低于250 mmol·L-1時，HATS在轉運系統中發揮主要作用，硝酸鹽濃度高于250 mmol·L-1時，LATS在轉運系統中發揮主要作用[9]。植物通過木質部將根中的NO3-轉運到地上部或直接在根部將其還原為NO2-，NO2-繼續被還原為NH4+，再同化為植物體所需的有機物質[10]。參與該同化過程的主要有硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）、亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NIR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和谷氨酸合酶（glutamate synthase，GOGAT）。NR和NiR主要參與硝酸鹽的兩步還原過程，NR將NO3-還原為NO2-，NiR將NO2-還原為NH4+，而NR的活性遠低于NiR，是硝酸鹽還原過程中的限速酶[11]。GS與GOGAT則將NH4+同化為谷氨酰胺和谷氨酸。對于油菜而言，其生物量被證實與氮素利用效率（nitrogen use efficiency，NUE）存在關聯。顧熾明等[12]在2個氮水平條件下對162份油菜種質進行了氮效率評價和基因型差異分析，結果顯示，油菜生物量、主根長、側根長、根冠比、氮累積量及氮吸收和利用效率在不同氮水平處理間差異極顯著，因此，該研究認為油菜的苗期以生物量作為評價標準來衡量油菜NUE是一種行之有效的途徑。隨著測序技術的快速發展和成本的不斷下降，全基因組關聯分析成為一種獲取候選基因的有效途徑。Ahmad等[13]通過GWAS、加權基因共表達網絡和差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的綜合分析，發現了16個基因參與了低氮脅迫下油菜的根系發育，揭示了氮脅迫的遺傳基礎，為油菜氮素利用率的遺傳改良提供了有價值的SNP位點。Li等[14]研究發現甘藍型油菜氮素吸收和利用效率、光合作用及碳氮代謝是影響其氮利用效率的主要原因，并確定了可以提高甘藍型油菜氮利用效率的候選基因。He等[15]對甘藍型油菜的氮同化基因（nitrogen assimilation genes，NAG）進行了全基因組分析，共鑒定出67個NAG編碼與氮同化有關的主要酶，還發現了12個響應氮饑餓的樞紐基因，這些基因可能在氮素利用中發揮重要作用，為進一步研究NAG在油菜氮素同化中的功能提供了依據，同時也為NAG在不同養分脅迫下的響應提供了新的思路。【本研究切入點】在長期高氮肥的施用和選擇育種過程中，導致氮高效等重要基因資源的丟失，以致目前主栽品種氮肥利用率普遍偏低[16-18]。而相對于我國廣泛種植的甘藍型油菜，芥菜型油菜具有極豐富的遺傳變異資源，且更耐低氮、耐貧瘠，是挖掘油菜氮高效優異基因的寶貴材料。【擬解決的關鍵問題】本研究通過對153份芥菜型油菜種質在不同氮水平下進行苗期氮效率相關性狀的調查，以此開展油菜氮效率相關性狀的全基因組關聯分析，鑒定油菜氮效率候選基因，為揭示油菜氮高效分子機制和創制氮高效油菜新品種提供理論基礎和優異基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以153份芥菜型油菜品種（系）組成的自然群體為試驗材料，包括國內品種84個、國外品種58個及地理來源未知品種11個。

1.2 試驗設計

試驗于2021和2022年在湖南農業大學進行，參考Hoagland營養液配方配制試驗所用營養液，并根據芥菜型油菜的營養特性進行適當修改，設置低氮（0.25 mmol·L-1N）和正常氮（4 mmol·L-1N）2個處理，各處理設置3個生物學重復。晝夜溫度設為22℃，光照/黑暗時間為16 h/8 h，光照強度為300— 320 μmol·m-2·s-1，相對濕度為60%—75%。選擇圓潤飽滿種子，將種子用去離子水浸泡24 h，期間換水5—6次。將浸泡后的種子均勻播種在塑料育苗盤表面固定的紗布上，育苗盤中加適量的超純水。育苗7 d后，每個材料選擇長勢一致的3株幼苗移栽到盛有40 L Hoagland營養液的黑色塑料水產盒中。根據芥菜型油菜幼苗營養需求，出苗后的植株先移到1/4濃度的全量營養液，然后，低氮處理的植株用0.25 mmol·L-1N的營養液培養，正常氮處理的植株依次更換為1/2濃度營養液和全量營養液。培養過程中，每隔3 d更換1次營養液，24 h不間斷通氣，培養18 d收獲。整個試驗重復2次。

1.3 測定指標、方法及計算方法

將樣品收獲后105 ℃殺青30 min，然后65 ℃烘干至恒重，用萬分之一電子天平稱量地上部生物量（shoot dry weight，SDW）與根系生物量（root dry weight，RDW），計算植株根冠比（root-shoot ratio，RSR）=RDW/SDW。采用H2SO4-H2O2消煮法和K9840自動凱式定氮儀測定地上部氮含量（shoot nitrogen concentration，SNC）[19]。通過Excal 2019軟件對表型數據進行描述性統計并作圖，以SPSS 19.0軟件對數據進行相關性分析和方差分析。

1.4 SNP、親緣關系與群體結構分析

根據湖南農業大學劉忠松課題組480份芥菜型油菜種質，重測序后鑒定出約453萬個SNP[20]。利用VCFTOOLS軟件提取出本試驗所需的153份種質SNP多態性信息，共獲得4 529 618個SNP。使用PLINK軟件過濾掉次要等位基因頻率小于5%的位點及缺失率大于80%的位點，最終獲得3 944 772個高質量的SNP。親緣關系分析利用TASSEL V5.0軟件進行，用ADMIXTURE V1.30軟件對=2—10進行聚類運算，交叉驗證錯誤（cross-validation errors，CV）值最低的為最優群體結構[21]。

1.5 全基因組關聯分析

通過對2次重復試驗（R1和R2）測定的根冠比和地上部氮含量的相對值（低氮/正常氮）進行關聯分析。利用TASSEL V5.0軟件中的一般線性模型GLM（群體結構矩陣作為固定效應）和混合線性模型MLM（群體結構和親緣關系矩陣同時作為固定效應）分別對關聯群體進行全基因組關聯分析，通過2種模型QQ圖的比較，選擇最優模型。Bonferroni閾值為-log10()，顯著關聯SNP寬松閾值設為4.0，嚴謹閾值設為4.5。關聯分析中所用到的曼哈頓圖和QQ圖均由R軟件中的CM plot包完成。

1.6 候選基因篩選和單倍型分析

基于已公布的芥菜型油菜基因組序列[20]，在全基因組關聯分析中檢測到的顯著關聯的SNP位點上下游200 kb范圍內篩選出與氮效率相關的基因。進一步利用目前芥菜型油菜基因組的注釋信息及其與擬南芥基因的共線性關系，根據擬南芥中已經明確功能的氮效率相關基因，篩選出候選區段內與氮效率相關同源基因。利用Haploview軟件進行候選基因單倍型分析，并基于候選基因中MAF＞0.05的所有SNP，對單倍型進行分類。

2 結果

2.1 氮效率相關性狀的表型變異

通過對153份芥菜型油菜進行氮效率相關性狀分析發現，在低氮/正常氮條件下，這些性狀的相對值均表現出廣泛的表型變異。相關性分析表明，2次重復試驗的根冠比和地上部氮含量的相對值均顯著相關，相關系數超過0.85（表1）。在第一次試驗中，根冠比相對值（RRSR1）變異幅度為0.59—2.44，平均值為1.46，變異系數為23.97%；地上部氮含量相對值（RSNC1）變異幅度為0.29—0.83，平均值為0.48，變異系數為22.92%。第二次試驗中，根冠比相對值（RRSR2）變異幅度為0.66—1.83，平均值為1.16，變異系數為23.28%；地上部氮含量相對值（RSNC2）變異幅度為0.21—0.78，平均值為0.42，變異系數為26.19%。2次重復試驗的根冠比和地上部氮含量的相對值均呈正態分布（圖1）。表明這些氮效率相關性狀受多基因控制，屬于數量性狀遺傳。

表1 氮效率相關性狀的表型變異

RRSR：根冠比相對值；RSNC：地上部氮含量相對值；1和2表示同一性狀的第1和第2次試驗；**表示在＜0.01水平下差異顯著。下同

RRSR: relative values of root-shoot ratio; RSNC: relative values of shoot nitrogen concentration; 1 and 2 represent experiment replicate 1 and replicate 2 of the same trait; **Significant at＜0.01. The same as below

圖1 氮效率相關性狀的頻次分布圖

2.2 親緣關系分析和群體結構分析

利用3 944 772個高質量SNP位點對153份芥菜型油菜種質進行親緣關系和群體結構分析。親緣關系頻次分布圖（圖2-a）及熱圖顯示（圖2-b），約60%供試材料親緣關系值等于0，表明整個群體材料之間的親緣關系較遠，具有足夠的遺傳差異性，符合進行全基因組關聯分析的要求。

群體結構分析表明，在=6時，交叉驗證錯誤最小，即=6時為最佳亞群數目（圖3-a）。而PCA分析結果表明，前2種成分解釋的遺傳方差分別為12.7%和7.57%，這153份芥菜型油菜群體被劃分為6個亞群（圖3-b）。因此，將=6時生成的群體結構矩陣，用于性狀與標記的關聯分析。

2.3 關聯分析模型的選擇

采用TASSEL V5.0軟件中的一般線性模型GLM（群體結構矩陣作為固定效應）和混合線性模型MLM（群體結構和親緣關系矩陣同時作為固定效應）分別對153份芥菜型油菜進行氮效率相關性狀的全基因組關聯分析。通過比較2種模型下QQ圖的分布（圖4），發現在這些性狀中GLM模型始終優于MLM模型。因此，選擇GLM模型作為最終分析模型來尋找關聯位點。

a：親緣關系頻率圖；b：親緣關系熱圖 a: Frequency plot of relatives; b: Kinship heatmap

a：交叉驗證錯誤值；b：主成分PC1、PC2的散點分布 a: Cross validation error values; b: Plots of the first two principal components (PC1 and PC2)

圖4 氮效率相關性狀在GLM模型和MLM模型中的QQ圖

2.4 氮效率相關性狀的全基因組關聯分析

選取GLM模型對153份芥菜型油菜材料氮效率相關性狀進行GWAS分析。由于RRSR1和RRSR2關聯到的共同位點較少，采用寬松閾值-log10()＞4（表2、圖5-a和圖5-c），而RSNC1和RSNC2關聯到的共同位點較多，所以篩選顯著關聯SNP時采用嚴謹閾值-log10()＞4.5（表2、圖5-b和圖5-d）。結果表明，RRSR1和RRSR2共同關聯到的顯著SNP位點有16個，分別位于A01、A02、A04和A05染色體上。這些位點可解釋的表型變異率為10.69%— 15.39%。RSNC1和RSNC2共同關聯到的顯著SNP位點共有29個，分別位于A01、A02、A06、A07和B01染色體上。這些位點可解釋的表型變異率為13.22%—23.96%。

2.5 候選基因預測及單倍型分析

共篩選出15個與氮效率相關候選基因（表3）。其中，RSNC關聯到29個顯著SNP位點，篩選出7個氮效率相關候選基因，包括、、、、、和。RRSR關聯到16個顯著SNP位點，篩選出8個氮效率相關候選基因，分別為、、、、、、和。通過對其進行單倍型分析（圖6），結果表明，候選基因、、、、、、、、和的單倍型間的RRSR或RSNC均存在顯著差異，單倍型Hap1為它們的優勢單倍型。其中，、、和在關聯群體中可分為3種單倍型；、和可分為4種單倍型；和可分為5種單倍型；可分為6種單倍型。

圖5 氮效率相關性狀的全基因組關聯分析

表2 關聯分析中同一性狀檢測到的共同顯著SNP位點

RRSR和RSNC：兩批數據根冠比和地上部氮含量相對值的平均。箱線圖頂部的不同字母表示在P＜0.05水平差異顯著

表3 顯著性SNP位點側翼序列200 kb內的氮效率相關候選基因

3 討論

3.1 芥菜型油菜氮效率GWAS分析

全基因組關聯分析是一種用于探究多種性狀與基因組中遺傳變異間關系的分析方法，也是解析數量性狀遺傳機制的有力工具。隨著甘藍型油菜基因組序列的發布以及SNP芯片的開發，加快了油菜重要數量性狀的定位研究[22]。目前，全基因組關聯分析已經在油菜種子品質[23]、干旱脅迫[24]、鹽脅迫[25]、株高[26]、千粒重[27]和開花時間[28]等許多方面實現了應用研究，鑒定了大批控制油菜重要性狀的位點。而關于芥菜型油菜氮效率相關性狀的全基因組關聯分析及其氮效率相關基因挖掘的研究卻相對較少。芥菜型油菜是一種重要的農業作物，其氮效率是影響產量和質量的關鍵性狀之一。本研究采用GLM模型對153份芥菜型油菜的氮效率相關性狀進行全基因組關聯分析，共檢測到45個與氮效率相關性狀顯著關聯的SNP位點，分布在A01、A02、A04、A05、A06、A07和B01染色體上。由于GWAS已被用于芥菜型油菜氮效率相關性狀研究[29-31]，因此，將本研究中的關聯結果與以前的工作進行了比較。遺憾的是，在它們之間沒有發現相同的SNP。但令人鼓舞的是，AKHATAR等[29]檢測到的9個SNP在本研究檢測到的SNP位點（A02：31293392、A05：22237279和A07：29692636—29693369）的3—9 mb范圍內。而前人研究檢測到的一些位點在本研究中未被發現，可能是受到試驗條件、供試材料及用于關聯分析的表型性狀等因素的影響。

3.2 氮效率相關候選基因預測

本研究挖掘出15個可能與芥菜型油菜氮效率有關的候選基因，位于A02、A05上的5個基因、、、和編碼硝酸鹽轉運蛋白，為硝酸鹽轉運蛋白家族基因，介導擬南芥硝酸鹽的吸收和轉運[32]。為NRT2家族基因，擬南芥在種子硝酸鹽積累中起著特定的作用[33]，另外還有研究表明，花生能夠提高植物氮代謝過程的氮素利用率[34]。擬南芥在鹽脅迫下促進硝酸鹽向地上部的轉運[35]。的擬南芥同源基因，編碼液泡硝酸鹽轉運蛋白，介導擬南芥液泡內NO3?/H+交換[36]。同時，Li等[14]通過對不同氮素利用效率的甘藍型油菜的基因組和轉錄組分析篩選到液泡硝酸鹽轉運蛋白。突變增加了其對多胺的抗性，而多胺的運輸或代謝與植株地上部薄壁組織中硝酸鹽的運輸有關[37]。位于A01、A04上的4個與植物生長發育相關的候選基因BjuCOBL8、、和BjuUP3，COBL8參與調節細胞壁擴張，與CesA基因家族的一些成員共同表達[38-39]。是一個脫落酸受體基因，是水稻生長發育和抗旱性的關鍵調控因子[40]。是SAUR41亞家族基因中的一員，擬南芥SAUR41亞家族基因是受脫落酸誘導的，可調節細胞擴張、離子穩態和耐鹽性[41]。UP3為過氧化物酶體蛋白，植物過氧化物酶體是高度動態的細胞器，介導一系列對發育至關重要的代謝過程[42]。位于A01、A04和A07上的3個基因、和參與植物體內氮代謝的過程。編碼天冬酰胺合成酶，參與植物氮代謝的過程[43-44]。陳敬東[45]通過對232份甘藍型油菜種質進行全基因組關聯分析并結合轉錄組分析，篩選到1個與編碼擬南芥天冬酰胺合成酶家族蛋白的ASNS同源基因，這與本研究中篩選到的候選基因位于同一蛋白家族，可能具有相似的功能。可能在根系初級氮同化中起主要作用[46]。對葉酸的生物合成起著至關重要的作用而葉酸在氮代謝中具有調節作用，因此，可能間接地調節氮代謝[47-48]。位于A01、A02和A04上的3個基因、和參與植物對非生物脅迫的反應，JUB1是一個NAC轉錄因子，有研究表明通過直接（或部分間接）調控赤霉素和油菜素內酯的生物合成和信號通路，負向調控整合植物生長和非生物脅迫反應[49]。為BHLH家族轉錄因子，可能非生物脅迫反應中發揮功能[50]。可能參與各種脅迫應答，并在脅迫響應中發揮功能[51]。HU等[52]通過對418份不同品種甘藍型油菜全基因組關聯研究發現了56個重要農藝性狀的628個相關位點候選基因，包括植株構型和產量性狀。將其研究結果與本研究篩選到的候選基因進行比較，沒有發現相同的候選基因，這可能是由于試驗條件、供試材料及用于關聯分析的表型性狀等因素所導致的。候選基因單倍型分析結果表明，、、、、、、、、和的單倍型之間存在顯著差異，這意味著這些基因在自然群體中可能存在優異的自然等位變異。因此，在后續的功能驗證中可進一步研究這些基因的差異位點，將有助于揭示芥菜型油菜氮高效的遺傳機制，為提高油菜氮效率和創制氮高效品種提供遺傳理論指導。

4 結論

獲得45個與氮效率相關性狀顯著關聯的SNP位點。最終篩選出15個可能與芥菜型油菜氮效率直接或間接相關的候選基因，分別編碼不同的轉運蛋白、生長調節因子、跨膜蛋白、激素受體及代謝相關蛋白，可能通過參與跨膜運輸、生長發育、逆境響應及代謝等途徑來調控油菜氮效率。

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Genome-Wide Association Study of Nitrogen Efficiency Related Traits at Seedling Stage in

ZENG Jian1, WANG RuMeng1, GONG Pan1, YANG Xiao1, YIN XiaoQi1, LI JiangHe1, CHEN ShiLong1, YAO Lei1, SONG HaiXing1, KANG Lei2, ZHANG ZhenHua

1College of Resources, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;2College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128

【Objective】The genome-wide association analysis was performed to identify SNP loci significantly associated with nitrogen use efficiency (NUE) traits inat seedling stage and to predict the relevant candidate genes, providing a theoretical basis for revealing the molecular mechanism of nitrogen use efficiency in rapeseed and creating nitrogen-efficient germplasm. 【Method】The population of 153resources was used as the analysis population. Two treatments, low N and normal N, were established using three replicates for each treatment, and two replicated nutrient culture trials were conducted over a two-year period (2021 and 2022). The relative values of root-shoot ratio and shoot nitrogen concentration (low/normal N) were calculated and utilized as NUE traits for a genome-wide association study (GWAS) aimed at exploring candidate genes for NUE. 【Result】NUE traits ofresources exhibited abundant variation, ranging from 0.21-2.44 with coefficients of variation of 22.92%-26.19%. The GWAS identified 45 significant SNP loci, among which 16 overlapped between the first relative root-shoot ratio (RRSR1) and the second relative root-shoot ratio (RRSR2), accounting for a phenotype variance range of 10.69%-15.39%. Additionally, 29 significant SNP loci were shared between the first relative shoot nitrogen concentration (RSNC1) and the second relative shoot nitrogen concentration (RSNC2), explaining a phenotype variance range of 13.22%-23.96%. 15 candidate genes for NUE were identified within 200 kb upstream and downstream regions of significant SNP loci, including 5 genes related to nitrate transport (,,,and), 3 genes associated with nitrogen metabolism (,and), 4 genes involved in plant growth and development (,,and) and 3 genes participated in stress response (,and). 【Conclusion】45 SNP loci were detected significantly associated with NUE traits and 15 candidate genes for NUE were identified in this study.

Brassica juncea; nitrogen use efficiency traits; GWAS; candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.20.003

2023-04-10；

2023-06-09

國家自然科學基金聯合基金重點項目（U21A20236）、國家自然科學基金面上項目（32072664）、湖南省科技創新領軍人才項目（2022RC3053）、湖南省自然科學基金杰出青年基金（2021JJ0004）

曾健，E-mail：1214223485@qq.com。王茹夢，E-mail：15526461183@163.com。曾健和王茹夢為同等貢獻作者。通信作者康雷，E-mail：kanglei@hunau.edu.cn。通信作者張振華，E-mail：zhzh1468@163.com

（責任編輯 李莉）