獸用疫苗生產中常用細胞系的致瘤性研究

劉昕澤，宗樹成，王楠，張賀楠，謝云浩，郭富城，巴利民

（1.中牧實業股份有限公司 北京 100070；2.農業農村部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室 北京 100095）

細胞培養技術為幾個世紀以來疫苗生產的最關鍵的一個里程碑，最初的疫苗來源于被感染機體的體液、組織或者器官，最常用的是使用感染的鼠（小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠等）、兔子、羊等動物的組織器官經研磨后獲得。1930 年后，研究人員開始使用雞胚進行病毒培養，并用于人和動物疫苗生產，目前該方法仍然被大量使用，但SPF 雞胚的來源受限，供應不足，疫苗生產周期長、產量低等特性，科研人員開始尋求更為方便的易于大規模培養的病毒培養方法，因此細胞培養技術被應用到疫苗生產[1,2]。最初使用的細胞基質是從動物體內分離出來的原代細胞，不進行凍存儲備或者在一定程度上作為基礎細胞庫進行少量凍存。原代細胞增殖能力有限，傳代的代次往往不高于5 代，因此每批疫苗都必須重新制備新的原代細胞。此外原代細胞分離培養時受動物個體差異，存在污染風險、批間差較大等問題。隨著對疫苗產量需求和疫苗安全性要求越來越高，迫切需要開發出安全、穩定、經濟、高效的疫苗生產用細胞基質。有研究人員在1954 年使用猴腎細胞生產脊髓灰質炎病毒，成為疫苗領域的一個標志性事件[3,4]。此后，MDBK、HEK293、MDCK、EB66、BHK-21、PK、ST、marc145 等細胞陸續被開發，應用于人或動物疫苗生產。這些細胞均表現出無限增殖的能力，疫苗生產時建立基礎種子庫和生產用細胞種子庫，可隨時從細胞庫中復蘇細胞進行疫苗生產[5]。但是這些細胞系進行持續傳代時存在染色體遺傳變異的可能性，具有潛在的遺傳不穩定性和致瘤性。因此在疫苗生產中必須限定細胞代次進行使用，只有傳代代次較低的非致瘤性的細胞方可用于疫苗生產。在產品申報和疫苗生產時對生產用細胞基質進行致瘤性檢驗尤為重要[6]。為確保生物制品的安全性，本文根據WHO 和2020 年版《中華人民共和國獸藥典》推薦的方法，對目前實驗室保存的幾種用于研發生產的傳代細胞系致瘤性進行了系統研究，為在獸用生物制品研發、生產中如何正確規范使用細胞基質提供數據支撐[7]。

本實驗室保存的HEK-293 細胞系、LLC-PK1 細胞系、Marc145細胞系、PK15 細胞系、Vero 細胞系、ST 細胞系、BHK-21 細胞系均為獸用疫苗生物制品研發、生產中常見的傳代細胞系。其中HEK-293 用于腺病毒及其腺病毒載體等疫苗生產，HEK-293T 主要用于腺病毒的包裝和亞單位疫苗生產，Marc145 細胞應用在豬藍耳病等疫苗生產，PK15 細胞應用于豬圓環病等疫苗生產，Vero 細胞應用于犬瘟熱-狂犬病聯苗、豬乙型腦炎活疫苗等疫苗生產，ST主要應用于豬瘟、豬偽狂犬疫苗生產，BHK-21 細胞作為已知具有致瘤性的細胞，應用于口蹄疫、偽狂犬病、狂犬病、SVV 等滅活疫苗生產。本試驗對這7 種細胞進行致瘤性試驗，為生產獸用疫苗安全性評價提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1）細胞。HEK-293 細胞第30 代、HEK-293T 細胞第30 代、LLC-PK1 細胞第30 代、Marc145 細胞第30 代、PK15 細胞第35 代、Vero 細胞第140 代、ST 細胞第35 代、胎豬原代腎上皮細胞第8 代、BHK-21 細胞第50 代，上述使用細胞中，胎豬原代腎上皮細胞為實驗室使用SPF 胎豬腎組織自行分離的原代細胞，其余均為實驗室基礎種子庫細胞。其中Vero 為ATCC 引進細胞株，代次以ATCC 原始細胞代次進行記錄，其余細胞原始代次不清晰，以在本試驗開始傳代記錄為第一代。

2）試驗動物。Nu/Nu 裸鼠6 周齡雌鼠，共計90 只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于北京市海淀區興隆實驗動物養殖廠。

1.2 方法

1）試驗分組。將90 只裸鼠隨機平均分成9 組，每組10 只，分HEK-293 細胞組、HEK-293T 細胞組、LLC-PK1 細胞組、Marc145細胞組、PK15 細胞組、Vero 細胞組、ST 細胞組，每種細胞接種10 只裸鼠，胎豬原代腎上皮細胞陰性對照組和BHK-21 細胞陽性對照組各接種10 只裸鼠。

2）細胞收集與接種。將生長狀態良好的細胞消化、重懸、計數，試驗組每種細胞取2×108個細胞，陽性對照組取1×108個細胞，陰性對照組取2×108個細胞。

3）細胞接種。將收集的細胞1 000 r/min，離心5 min，分別用1 mL 無菌PBS 重懸。每只裸鼠右腋下皮膚消毒后，皮下緩慢注射0.1 mL 細胞懸液（表1）。

表1 試驗動物分組

4）觀察與剖檢。接種后的裸鼠每周觀察兩次，每次間隔3～4 d，觀察接種部位有無結節或腫塊。持續觀察至5 周，對各試驗組中出現腫塊的裸鼠進行剖檢，做病理切片分析；對各試驗組中未出現腫塊的裸鼠分別取半數做剖檢，做病理切片分析。陰性對照組和陽性對照組在5 周取半數剖檢，做病理切片分析。對剩余裸鼠持續觀察至12 周后，全部剖檢，做病理切片分析。

5）病理組織切片。裸鼠頸部脫臼處死后，剪開接種部位，取接種部位附近皮膚、頜下淋巴結、肺臟、皮下組織、肝臟、脾臟，如有結節或腫塊，取出皮下結節或腫塊，將組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，將固定后的樣品制備石蠟包埋切片，經H-E 染色后鏡檢。

2 結果與分析

2.1 陽性、陰性對照組結果

試驗觀察至5 周（第35 天），接種BHK-21 細胞系的陽性對照組內裸鼠肋下均出現明顯腫塊（圖1 A），腫塊直徑7.9～16.3 mm，精神萎靡，采食量下降，剖檢后發現，裸鼠的淋巴結、肺臟、肝臟均無明顯結節。對裸鼠的腫塊、淋巴結、肺臟、腎臟、肝臟進行病理切片檢測，結果顯示，腫塊組織細胞異型性大，核分裂明顯，核仁大而清晰，成團塊或島嶼型（圖2 A）。部分裸鼠病理切片顯示肺臟有轉移現象（圖2 B）。接種胎豬原代腎上皮細胞系的陰性對照組內裸鼠，精神、飲食未出現異常表現，接種部位無明顯結節和腫塊產生（圖1 B），剖檢后頜下淋巴結、肺臟、腎臟、肝臟未出現異常。病理切片檢測結果，未發現腫瘤細胞。

圖1 裸鼠病理解剖學檢查

2.2 試驗組結果

試驗觀察至5 周（第35 日），接種HEK-293、LLC-PK1、Marc145、PK15、Vero、ST 細胞系的各試驗組裸鼠，精神、飲食未出現異常表現，未見結節或可疑腫塊組織（圖1 C、E、F、G、H、I）。從各組中分別取5 只裸鼠進行剖檢，對接種部位皮膚、淋巴結、肺臟、腎臟、肝臟進行病理切片檢測，未發現腫瘤細胞。繼續飼養觀察至12周后，將各組剩余裸鼠全部剖檢并對接種部位皮膚、淋巴結、肺臟、腎臟、肝臟組織進行病理切片檢測，均未發現腫瘤細胞。

試驗觀察至5 周（第35 日），接種HEK-293T 細胞系的裸鼠均出現精神萎靡、采食量下降的異常表現，接種部位均有可疑腫塊產生，腫塊直徑5.8～10.6 mm（圖1 D），對腫塊進行病理切片檢測為鱗狀細胞癌細胞（圖3 D）。對其他組織進行病理切片檢測，未發現有腫瘤細胞。

3 結果與討論

生產用細胞系一般由人或動物原代細胞或細胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化特性或特異性標記的細胞群。2020 版獸藥典生產用細胞標準致瘤性檢驗要求，對至少10 無胸腺小鼠，各皮下或肌肉注射107個被檢細胞，持續觀察12 周，對接種部位進行剖檢及病理學檢查，各淋巴結和各器官中應均無結節及腫瘤，以確保在生物制品生產時不會產生致瘤性。

本文對動物生物制品研發、生產中7 種常見細胞系的致瘤性進行了系統研究，可見HEK293-T 細胞對裸鼠具有致瘤性，未發生轉移。陽性對照BHK-21 細胞系接種后腫瘤細胞由接種部位轉移，在肺部組織中可觀察到肺部鱗狀細胞瘤細胞，因此HEK293-T 細胞、BHK-21 細胞不能用于活疫苗的生產，當用于滅活苗生產時需系統評估制品經滅活劑滅活后細胞基因組核酸對動物機體存在的潛在致瘤性風險。本實驗室保存的HEK-293、LLC-PK1、Marc145、PK15、Vero、ST 細胞系無致瘤性，但有些研究表明Vero、Marc145、HEK-293 細胞存在致瘤性[8]，這種結果差異可能是因為細胞代次不同或者細胞高變異株亞型引起的，因此用于生物制品生產的細胞基質必須在限定代次內使用，不可高于規定的最高代次，以免出現致瘤性風險[9]。■