石崖茶水提取物抗氧化活性研究

程忠泉,葉紅慶,馮月燕,楊 丹

(1.廣州衛生職業技術學院藥學院,廣東廣州 510450;2.廣東醫科大學藥學院,廣東東莞 523808)

石崖茶系山茶科(Theaceae)楊桐屬(Adinandra)植物亮葉楊桐(AdinandranitidaMerr.ex Li)的干燥葉[1],又名猴茶、石芽茶、石巖茶等,分布于廣西、廣東、貴州等地,生長于海拔500～1 000 m的溝谷溪邊、林緣、林中或石巖邊[2]。石崖茶味甘、微苦,性涼,歸肝、膽、胃經。石崖茶不含咖啡堿,茶色碧綠,飲后有回甘[3],不影響睡眠[4],具有抗菌、抗腫瘤、護肝明目、消炎、清熱解毒、養顏、降血壓、健胃消食等作用[5-6],可用于目赤腫痛、目暗干澀、癰瘡腫毒、黃疸等[7],在壯、瑤、苗、侗等少數民族地區有著悠久的使用歷史[8],常用于治療咽喉炎、腮腺炎、肥胖癥、糖尿病、高血壓、高血脂、痢疾等疾病[9-10]。石崖茶含茶堿量低,黃酮含量高,有很高的開發利用價值,榮獲“中國名優茶葉”[11]稱號。該研究對石崖茶水提取物經大孔樹脂用不同濃度乙醇洗脫后各部分的抗氧化活性進行分析,以進一步挖掘該植物的研究與應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試劑。DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、維生素C、1,10-鄰菲啰啉、鄰苯三酚、Na2HPO4、NaH2PO4、硫酸亞鐵銨[FeSO4(NH4)2SO4]、H2O2、鐵氰化鈉、三氯乙酸、FeCl3、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、乙醇等,以上試劑均為分析純。

1.1.2儀器。TU-1901雙波長紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;電子分析天平,青島精誠儀器儀表有限公司;101-3AB型電熱鼓風干燥箱,天津市泰斯儀器有限公司;501型超級恒溫水浴鍋,上海試驗儀器有限公司。

1.1.3試材及其處理。石崖茶于2020年6月采自桂林平樂。石崖茶干燥后粉碎,稱取100 g,1 000 mL水80 ℃熱提2次,每次1 h,合并提取液,放冷后上大孔吸附樹脂,分別以0、50%、70%、100%乙醇沖洗,濃縮干燥后得各濃度乙醇沖洗物粉末。

1.2 試驗方法

1.2.1DPPH自由基清除率的測定。

1.2.1.1VC對DPPH自由基的清除率。精密稱取DPPH粉末0.010 g,用95%乙醇溶解并定容至100 mL,配制成0.1 mg/mL的乙醇樣液。取7個10 mL容量瓶,分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的0.1 mg/mL 的VC,然后再分別向7個容量瓶中加入1.0 mL 0.1 mg/mL 的DPPH溶液,搖勻,用95%乙醇定容至刻度。室溫下,暗處反應30 min,然后在517 nm波長處迅速測其吸光度,以不加樣液溶液為空白,用乙醇溶液參比,計算出VC對DPPH自由基的清除率,公式如下:

(1)

式中:A0為不加樣液時的吸光度;A樣為加VC的吸光度。

1.2.1.2樣品對DPPH自由基的清除率。分別精密稱取50%、70%、100%乙醇沖洗的石崖茶大孔樹脂洗脫物0.010 0 g樣品粉末,用95%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成0.1 mg/mL樣品溶液。取7個10 mL容量瓶,分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的0.1 mg/mL的樣品溶液,測定吸光度,并計算各洗脫物對DPPH自由基的清除率,計算公式如下:

(2)

式中:A0為不加樣液時的吸光度;A樣為加DPPH的吸光度;A樣0為樣品本身的本底值。

1.2.2羥基自由基清除率的測定。

1.2.2.1溶液配制。

(1)溶液Ⅰ。分別取10 mmol/L的FeSO4溶液、10 mmol/L的H2O2溶液、30 mmol/L的水楊酸乙醇溶液各100 mL,依次加至棕色瓶中,振蕩搖勻,于37 ℃烘箱中恒溫15 min。

(2)溶液Ⅱ。分別取10 mmol/L的FeSO4溶液、蒸餾水、30 mmol/L的水楊酸乙醇溶液各100 mL,依次加至棕色瓶中,振蕩搖勻,于37 ℃烘箱中恒溫15 min。

(3)VC或樣品溶液。精密稱取10 mg VC或樣品粉末,用95%乙醇溶解并定容至10 mL,配制成1 mg/mL VC或樣品溶液。

1.2.2.2VC對羥基自由基的清除率。取6個10 mL容量瓶,先向容量瓶中加入5.0 mL溶液Ⅰ,再依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的1 mg/mL的VC溶液,以蒸餾水定容至10 mL,搖勻,然后將6個容量瓶一起置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min,以不加VC溶液為空白溶液,用蒸餾水做參比,在510 nm測定吸光度,并計算出VC對DPPH自由基的清除率,公式如下:

(3)

式中:A0為以蒸餾水代替VC的吸光度;A樣為加VC的吸光度。

1.2.2.3樣品對羥基自由基的清除率。取6個10 mL容量瓶,分別加入5.0 mL溶液Ⅰ,然后再分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的1.0 mg/mL的樣品溶液,用蒸餾水定容至刻度;另取6個10 mL容量瓶,分別加入溶液Ⅱ,然后再分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的1 mg/mL的樣品溶液,用蒸餾水定容至刻度。一起置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min,以蒸餾水做參比,以不加樣液為空白溶液,于510 nm處測定吸光度,并計算出各溶液對羥基自由基的清除率,公式如下:

(4)

式中:A0為以蒸餾水代替樣液的吸光度;A樣為加樣液的吸光度;A樣0為樣液本身的本底值。

1.2.3超氧陰離子自由基清除率的測定。

1.2.3.1VC和樣品溶液的配制。精密稱取VC或樣品粉末0.001 0 g,用乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成0.1 mg/mL VC或樣品溶液。

1.2.3.2VC和樣品對超氧陰離子自由基的清除率。取7個10 mL容量瓶,分別加入5.0 mL預先于25 ℃恒溫水浴鍋中預熱20 min的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH = 8.0),然后分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的0.1 mg/mL的VC或樣品溶液,再分別加入0.5 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液,充分混勻后置于25 ℃恒溫烘箱中準確反應5 min,立即加入10 mmol/L濃鹽酸終止反應,于420 nm處測定吸光度。以相同體積的蒸餾水代替樣液做空白試驗,用蒸餾水做參比。VC和樣品對超氧陰離子自由基的清除率計算見公式(1)和公式(2)。

1.2.4還原能力的檢測。

1.2.4.1溶液配制。精密稱取VC或樣品粉末0.005 g,用乙醇溶解并定容至10 mL,再從中移取1 mL定容至10 mL,最終配制成0.05 mg/mL VC或樣品溶液。

1.2.4.2VC和樣品的吸光度。取7個10 mL容量瓶,分別向其加入1.0 mL pH = 6.6的緩沖溶液,再分別加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL的0.05 mg/mL的VC或樣品溶液,然后再分別加入1.0 mL 1%鐵氰化鉀(淡黃色)溶液,在50 ℃恒溫烘箱中反應20 min,冷至室溫,再加入1.0 mL 10%三氯乙酸,如有沉淀,混合后以3 000 r/min分離10 min,取上層清液2.0 mL,加入0.5 mL 0.1% 的三氯化鐵溶液(普魯士藍),混勻,用蒸餾水定容至10 mL,在700 nm處測吸光度。

2 結果與分析

2.1 樣品對DPPH自由基的清除率由圖1可知,石崖茶各乙醇洗脫物對DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而增大,且均低于對照品VC。石崖茶70%乙醇洗脫物對DPPH自由基的清除能力最強,濃度在0.006 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率為68.8%;其次是50%乙醇洗脫物,濃度在0.006 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率為42.6%;100%乙醇洗脫物對DPPH自由基的清除能力最弱,濃度在0.006 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率僅為13.6%。

圖1 不同乙醇濃度大孔樹脂洗脫物對DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH radical by macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

2.2 樣品對羥基自由基的清除率由圖2可知,石崖茶各乙醇洗脫物對羥基自由基的清除率隨濃度的增加而增大,且均低于對照品VC。石崖茶100%乙醇洗脫物有較強的清除能力,但在濃度為0.25 mg/mL時,對羥基自由基的清除率仍僅為34.6%;50%和70%的乙醇洗脫物對羥基自由基的清除率相近,在濃度為0.25 mg/mL時,對羥基自由基的清除率分別為15.2%、18.5%。

圖2 不同乙醇濃度大孔樹脂洗脫物對羥基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of p-hydroxy radical by macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

2.3 樣品對超氧陰離子自由基的清除率由圖3可知,石崖茶各乙醇洗脫物對超氧陰離子自由基的清除率隨濃度的增加而增大,且均低于對照品VC。石崖茶50%乙醇洗脫物有較強的清除能力,但在濃度為0.025 mg/mL時,對超氧陰離子自由基的清除率仍僅為48.4%。70%和100%的乙醇洗脫物對超氧陰離子自由基的清除率相近,在濃度為0.025 mg/mL時,對超氧陰離子自由基的清除率分別為27.7%、14.6%。

圖3 不同乙醇濃度大孔樹脂洗脫物對超氧陰離子自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of superoxide anion radical by macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

2.4 樣品的還原能力由圖4可知,石崖茶各乙醇洗脫物還原能力隨濃度的增加而增大,且均低于對照品VC。石崖茶70%乙醇洗脫物有較強的還原能力,50%和100%的乙醇洗脫物的還原能力相近。

圖4 不同乙醇濃度大孔樹脂洗脫物的還原能力Fig.4 Reduction ability of macroporous resin rinses with different ethanol concentrations

3 結論

該研究對石崖茶水提取物經大孔樹脂用不同濃度乙醇洗脫后各部分的抗氧化活性進行了分析,結果發現50%、70%、100%乙醇洗脫物的DPPH自由基的清除率最高值分別為42.6%、68.8%、13.6%,對羥基自由基的清除率最高值分別為15.2%、18.5%、34.6%,對超氧陰離子自由基的清除率最高值分別為48.4%、27.7%、14.6%,以上3種濃度的乙醇洗脫物還原能力均不及VC。70%乙醇洗脫物具有較好的DPPH自由基清除率(68.8%),各洗脫物對羥基自由基、超氧陰離子自由基清除率及還原能力較弱。通過對石崖茶水提取物抗氧化活性的測定,進一步挖掘該植物的研究價值,有助于推動該種植物資源的學術研究及社會價值的挖掘,積極推進民族地方經濟發展。