基于線粒體Ctyb基因的滆湖3種黃顙魚遺傳多樣性分析

李大命,劉 洋,2,劉燕山,唐晟凱,谷先坤,殷稼雯

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所/江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點實驗室,江蘇南京 210017;2.南京師范大學海洋科學與工程學院,江蘇南京 210046)

黃顙魚屬(Pelteobagrus)為鲇形目(Siluriformes)鲿科(Bagridae)魚類,在江蘇省該屬魚類有黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、光澤黃顙魚(Pelteobagrusnitidus)、長須黃顙魚(Pelteobagruseupogon)和瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)4種,一般統(tǒng)稱黃顙魚[1]。黃顙魚屬魚類具有肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、無肌間刺等特點,因此廣受消費者歡迎,市場價格較高[2]。多年來,由于水體環(huán)境污染不斷加劇,濫捕濫撈現(xiàn)象日益嚴重,導致黃顙魚的棲息環(huán)境受到嚴重破壞,黃顙魚野生資源數(shù)量銳減,開展黃顙魚野生資源保護及相關(guān)研究顯得十分必要[3]。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分,是物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性和景觀多樣性的基礎,也是生命進化和適應的基礎。開展魚類遺傳多樣性的研究可以反映魚種的進化歷史,為分析其進化潛力提供參考;同時,還有利于分析物種稀有或瀕危的原因,為魚種保護提供參考[4-5]。魚類線粒體具有DNA分子小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、母系遺傳、重組率低等特點,使其成為分子標記在魚類進化遺傳學、群體遺傳結(jié)構(gòu)、分子生態(tài)學和保護生物學等研究領域的理想分子標記[6-7]。其中,細胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因進化速度適中,有通用引物可用于擴增和測序,是檢測魚類遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育的常用分子手段[8-10]。

滆湖位于江蘇省常州市西南,湖面面積146 km2,平均水深1.17 m,具有飲用、灌溉、航運和漁業(yè)等多種功能。近幾十年,由于捕撈強度過大、開捕年齡偏低、湖泊富營養(yǎng)化和環(huán)境污染加劇,導致滆湖漁業(yè)資源明顯衰退,魚類小型化現(xiàn)象嚴重[11-13]。黃顙魚是滆湖的常見魚類,經(jīng)濟價值較高,是漁民重要的捕撈對象。已有研究者利用Cytb基因和D-loop區(qū)序列研究了滆湖黃顙魚的遺傳多樣性[14-15],但有關(guān)滆湖光澤黃顙魚和長須黃顙魚的遺傳多樣性尚未見報道。筆者用線粒體Cytb基因作為分子標記,探索滆湖黃顙魚、光澤黃顙魚和長須黃顙魚的遺傳多樣性及進化歷史,以期為滆湖3種黃顙魚的野生種質(zhì)資源保護及合理利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理2019—2020年在滆湖設置3個漁獲物采樣點,開展?jié)O業(yè)資源調(diào)查。共采集黃顙魚49尾、光澤黃顙魚40尾、長須黃顙魚32尾,現(xiàn)場測量體長和體重。剪取樣本背部肌肉組織,保存于無水乙醇中固定,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴增和測序利用TaKaRa公司的DNA試劑盒提取肌肉組織的基因組DNA,最后用TE溶液溶解DNA。取少量DNA采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性,使用微量紫外分光光度計檢測其吸光值。

Cytb基因擴增和測序的引物為通用引物L14724和H15915[16],引物L14724為5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′,H15915為5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系(50 μL)如下:模板DNA 2 μL(100 ng),2×PCR Mix 25 μL(Taq酶2.5 U,dNTPs 10 μmol,MgCl20.1 mmol),上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,用水補足50 μL。PCR反應程序如下:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性45 s,58 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析利用DNAStar軟件包中SeqMan、EditSeq程序?qū)y序結(jié)果進行拼接,獲得Cytb基因序列。利用ClustalX 1.83軟件[17]對Cytb同源序列進行多重比對分析。采用MEGA 7.0軟件[18]統(tǒng)計堿基含量,基于Kimura雙參數(shù)模型計算種內(nèi)及種間遺傳距離,采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建3種黃顙魚單倍型的分子系統(tǒng)發(fā)育樹。利用DnaSP 6.0軟件[19]統(tǒng)計多態(tài)位點(variable site,V)、單倍型數(shù)量(haplotype number,N),計算單倍型多樣性(haplotype diversity,h)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,π)和平均核苷酸差異數(shù)(K)。

2 結(jié)果與分析

2.1Ctyb基因序列組成通過PCR擴增、測序和分析,獲得了3種黃顙魚的Cytb基因全序列。結(jié)果顯示,3種黃顙魚的Cytb基因長度均為1 138 bp,編碼379個氨基酸,其中黃顙魚Cytb基因的平均堿基含量為A 27.6%、T 26.6%、C 32.1%和 G 13.7%;光澤黃顙魚的平均堿基含量為A 29.3%、T 28.4%、C 29.1%和 G 13.2%;長須黃顙魚的堿基平均含量分別為A 27.4%、T 27.4%、C 31.5%和 G 13.7%。由此可見,3種黃顙魚均表現(xiàn)出堿基組成偏倚性,堿基A+T的含量大于堿基G+C的含量。所有序列均無堿基插入或缺失。

2.2Ctyb基因多態(tài)性49尾黃顙魚Cytb基因序列共檢測到23個多態(tài)位點,其中單一信息位點10個、簡約信息位點13個;49尾黃顙魚定義17種單倍型(HapPf1～HapPf17),單倍型多樣性為0.903,核苷酸多樣性為0.002 40。40尾光澤黃顙魚Cytb基因序列共檢測到25個多態(tài)位點,其中單一信息位點9個、簡約信息位點16個;40尾光澤黃顙魚定義17種單倍型(HapPn1～HapPn17),單倍型多樣性為0.936,核苷酸多樣性為0.004 59。32尾長須黃顙魚Cytb基因序列共檢測到20個多態(tài)位點,其中單一信息位點12個、簡約信息位點8個;32尾黃顙魚定義11種單倍型(HapPe1～HapPe11),單倍型多樣性為0.829,核苷酸多樣性為0.002 25(表1)。整體來看,3種黃顙魚的遺傳多樣性較為豐富,均呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性模式,遺傳多樣性從高到低依次為光澤黃顙魚、黃顙魚和長須黃顙魚。

表1 3種黃顙魚的遺傳多樣性參數(shù) Table 1 Genetic diversity parameters of three species of Pelteobagrus

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系分析采用MEGA 7.0軟件計算3種黃顙魚的種內(nèi)和種間遺傳距離,結(jié)果表明黃顙魚種內(nèi)遺傳距離為0～0.006,平均值為0.002;光澤黃顙魚種內(nèi)遺傳距離為0～0.012,平均值為0.005;長須黃顙魚種內(nèi)遺傳距離為0～0.008,平均值為0.002。3種黃顙魚種間遺傳距離為0.078～0.138,其中長須黃顙魚與黃顙魚的遺傳距離最小,長須黃顙魚與光澤黃顙魚的遺傳距離最大(表2)。

以長吻鮠(Leiocassislongirostris)為外類群,采用鄰接法構(gòu)建3種黃顙魚的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),結(jié)果表明3種黃顙魚均聚為獨立分支,且節(jié)點的置信度水平較高,分支的置信限水平均為100%。黃顙魚和長須黃顙魚最先聚集在一起,然后與光澤黃顙魚聚集在一起,表明黃顙魚和長須黃顙魚的親緣關(guān)系較近,與光澤黃顙魚的親緣關(guān)系較遠。

表2 3種黃顙魚的種內(nèi)及種間遺傳距離Table 2 Intraspecific and interspecific genetic distance of three species of Pelteobagrus

圖1 基于Cytb基因的黃顙魚單倍型分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The haplotype molecular phylogenetic tree of Pelteobagrus based on Cytb gene

2.4 種群歷史動態(tài)采用Arlequin 3.5軟件對3種黃顙魚進行Tajiam’sD和Fu’sFs中性檢驗,結(jié)果顯示3種黃顙魚的中性檢驗值均為負值,且大部分統(tǒng)計結(jié)果具有顯著差異(P<0.05)(表3)。另外,3種黃顙魚的核苷酸不配對分布圖總體上呈明顯的單峰型(圖2),均說明3種黃顙魚經(jīng)歷過明顯的種群擴張。

表3 3種黃顙魚的中性檢驗結(jié)果Table 3 The neutrality test results of three species of Pelteobagrus

3 討論

3.1 3種黃顙魚遺傳多樣性物種的遺傳多樣性反映一個物種對環(huán)境的適應能力、生存能力和進化潛力,其遺傳多樣性越豐富,對環(huán)境的適應能力就越大,生存和進化的能力也越強。一般來說,單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量某一物種遺傳多樣性的2個常用指標[20]。該研究結(jié)果表明,黃顙魚、光澤黃顙魚和長須黃顙魚的單倍型多樣性分別為0.903、0.936和0.829,核苷酸多樣性分別為0.002 40、0.004 59和0.002 25。3種黃顙魚的遺傳多樣性差異可能與有效種群數(shù)量、生態(tài)習性、環(huán)境壓力等因素有關(guān)。根據(jù)Grant等[21]提出的魚類遺傳多樣性標準,3種黃顙魚的遺傳多樣性均具有高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特點,其遺傳多樣性處于中等水平,這與我國黃顙魚其他水系地理群體的遺傳多樣性相一致。比如,長江、淮河水系安徽區(qū)段黃顙魚的單倍型多樣性為0.930、核苷酸多樣性為0.002 36[22],長江中下游5個湖泊黃顙魚的單倍型多樣性為0.945、核苷酸多樣性為0.004 19[14],珠江流域黃顙魚的單倍型多樣性為0.849、核苷酸多樣性為0.048 17[23],我國6個水系黃顙魚的單倍型多樣性為0.857、核苷酸多樣性為0.002 3[24]。從整體來看,我國黃顙魚的遺傳多樣性較為豐富,具有較強的環(huán)境適應能力、生存能力和進化潛力,但種群數(shù)量已大幅度減少,因此需要采取增殖放流、修復棲息環(huán)境等措施來恢復黃顙魚有效種群大小,進一步提高遺傳多樣性。

3.2 3種黃顙魚種群進化動態(tài)通常采用以下2種方法檢驗一個群體在歷史上是否發(fā)生過擴張:一種方法是中性檢驗,采用Tajima’sD和Fu’sFs檢驗推測種群歷史時如果Tajima’sD和Fu’sFs值呈負值,且在統(tǒng)計學上差異達到顯著水平,則說明序列中含有比中性進化模型更多的核苷酸位點變化,可能預示著該群體在歷史上有過擴張[25];另一種方法是核苷酸不配對分布,若其核苷酸不配對分布圖呈單峰曲線則指示近期群體發(fā)生過擴張[26]。

通過Arlequin 3.5軟件對3種黃顙魚Cytb基因序列進行中性檢測,獲得Tajima’sD和Fu’sFs值,結(jié)果表明3種黃顙魚的Tajima’sD和Fu’sFs值均小于0,且大部分統(tǒng)計檢驗結(jié)果具有顯著差異(P<0.05)。另外,3種黃顙魚群體的核苷酸不配對分布圖均呈明顯的單峰型,表明這3種黃顙魚可能經(jīng)歷了近期的群體擴張。庫喜英等[24]研究表明我國黃顙魚群體在10.1萬～14.1萬年前發(fā)生過擴張。另外,3種黃顙魚的遺傳多樣性模式也暗示著3種黃顙魚群體可能是由小的有效種群經(jīng)過一段時間的穩(wěn)定后發(fā)生了擴張,形成了高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特點[21]。

注:a.黃顙魚;b.光澤黃顙魚;c.長須黃顙魚。Note:a.P.fulvidraco;b.P.nitidus;c.P.eupogon.圖2 3種黃顙魚的核苷酸不配對分布圖Fig.2 The nucleotide pairwise difference distribution of three species of Pelteobagrus

3.3 3種黃顙魚遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳差異該研究結(jié)果顯示3種黃顙魚的種內(nèi)遺傳距離均較小,黃顙魚、長須黃顙魚種內(nèi)遺傳距離分別為0～0.006和0～0.008,平均值均為0.002;光澤黃顙魚種內(nèi)遺傳距離為0～0.012,平均值為0.005,表明種群內(nèi)個體間不存在遺傳分化。這是因為滆湖水面開闊,湖區(qū)間不存在地理隔離,3種黃顙魚在滆湖內(nèi)均是基因自由交流的群體。從單倍型組成來看,3種黃顙魚的單個體單倍型占比較大,比如黃顙魚種群的單個體單倍型占比為41.2%,2個體單倍型占比為35.3%;光澤黃顙魚種群的單個體單倍型占比為47.1%,2個體單倍型占比為11.8%;長須黃顙魚種群的單個體單倍型占比為72.7%。這說明3種黃顙魚的有效種群數(shù)量小,遺傳結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,易于波動[27]。

該研究中3種黃顙魚的種間遺傳距離為0.078～0.138,其中長須黃顙魚與黃顙魚的遺傳距離最小、與光澤黃顙魚的遺傳距離最大,說明長須黃顙魚與黃顙魚的親緣關(guān)系較近、與光澤黃顙魚的親緣關(guān)系較遠,這與丁言偉[28]采用線粒體ND4基因序列對黃顙魚屬的分子系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果相一致,而毛慧玲等[29]基于形態(tài)學參數(shù)的4種黃顙魚聚類結(jié)果與該研究結(jié)果不一致,說明黃顙魚屬的物種分類及親緣關(guān)系較為復雜,還有待進一步研究。梁宏偉等[30]探究了線粒體COI基因條形碼在鲿科魚類物種鑒定中的應用,其中黃顙魚、長須黃顙魚和光澤黃顙魚的種間遺傳距離為0.043 6～0.111 6,且光澤黃顙魚和長須黃顙魚的種間遺傳距離不到這2種黃顙魚種內(nèi)遺傳距離平均值的10倍。該研究結(jié)果顯示,基于Cytb基因的3種黃顙魚種間遺傳距離為這3種黃顙魚種內(nèi)遺傳距離平均值的10倍以上,因此線粒體Cytb基因比COI基因更適合作為鑒別黃顙魚的分子標記。