產酸菌的分離鑒定及在含氟土壤修復中的應用

張寶華,金 璐,沈曉莉*

(1.中國冶金地質總局浙江地質勘查院,浙江衢州 324000;2.衢州學院化學與材料工程學院,浙江衢州 324000)

氟是人和動物必需的微量元素,在自然界中廣泛分布,氟化工、電解鋁、鋼鐵、磷肥等工農業生產及人類活動造成含氟化合物進入環境[1],在土壤和沉積物中積累,影響作物生長[2],并通過食物鏈對動物或人體產生危害[2-4]。調查數據顯示,我國絕大多數地區存在著不同程度的地方性氟病。土壤氟污染治理及修復是值得關注的問題,目前氟污染土壤的修復除采用傳統的客土法、深埋法以外,還有化學鈍化、淋洗、電動修復、植物修復等技術[5-6]。

植物修復因具有高效、方便、成本低等優勢,是當前土壤修復的熱點。國內外研究者以土壤-植物系統為對象,對植物中有效態氟含量、富集能力、修復條件、影響因素等問題進行了廣泛研究[7-9]。研究發現,茶樹(Camelliasinensis)、國槐(Sophorajaponica)、刺槐(Robiniapseudoacacia)、合歡(Albiziajulibrissin)等植物對土壤氟具有較強的富集能力[7-8]。學者們普遍認為,植物組合技術可彌補植物單一修復技術的不足,其中利用植物-微生物聯合修復是一種環境友好、前景廣闊的綠色治理技術。1986年,Siegel等[10]首次報道真菌代謝作用產物能溶解重金屬及其礦物,促進植物對養分及污染元素的吸收。關于產酸菌在重金屬污染土壤修復中浸出、吸附等方面的應用研究有較多報道[11-13],而其在氟污染土壤修復中的應用研究很少。2003年,徐仁扣等[14]提出低分子有機酸可通過競爭吸附作用改變土壤氟含量,從而影響土壤氟的生物有效性,這為產酸菌去除重金屬以外的氟、磷等元素污染土壤的修復應用奠定了基礎。該試驗從厭氧污泥中篩選分離出一株產酸菌,采用16S rRNA序列分析技術對菌株進行分子生物學鑒定,并優化其產酸條件。以茶梅苗為研究對象,通過盆栽試驗,考察茶梅苗對土壤氟的吸收累積特征;同時將產酸菌應用于茶梅苗對氟污染土壤的修復中,比較修復效果,以探明產酸菌是否能有效促進植物對土壤氟的吸收,為氟污染土壤的綠色生態修復提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源菌株分離樣品來源于工業污水處理廠厭氧池。供試植物為1年生茶梅苗(Camelliasasanqua),購自衢州市三山花卉有限公司。

盆栽試驗供試土壤采集于衢州學院校園周邊農田表層(0～20 cm),除雜、風干、研磨后過20 目標準篩后密封保存備用。土壤基本理化性質:土壤 pH 6.1,有機質含量14.43 g/kg,銨態氮含量86 mg/kg,有效磷含量26.36 mg/kg,速效鉀含量213 mg/kg,全氟含量48.89 mg/kg。

1.2 培養基LB培養基:牛肉膏3.00 g,蛋白胨10.00 g,NaCl 5.00 g,瓊脂15.00～25.00 g,水1 L,pH 7.4～7.6。產酸菌培養基:葡萄糖20.00 g,蛋白胨5.00 g,牛肉膏3.00 g,酵母浸粉0.50 g,L-半胱氨酸0.50 g,NaCl 5.00 g,K2HPO40.50 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.50 g,水1 L,pH 6.5,固體培養基加1.5%的瓊脂。

1.3 產酸菌的篩選分離移取污泥懸液1 mL加至含50 mL LB培養基的150 mL錐形瓶中,于30 ℃恒溫培養箱富集培養48 h,取1 mL富集培養液,用滅菌水依次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。從10-4、10-5、10-6稀釋液中分別移取0.1 mL接種至產酸菌固體培養基上涂布分離,再挑取單菌落進行劃線分離直至得到單菌落,滴加酚紅溶液觀察菌落周邊顏色變化,將產生變色圈的菌株接種至產酸菌液體培養基,培養24 h后測定培養液pH,根據pH判定菌株產酸能力,復篩獲得產酸能力最佳菌株,甘油密封后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 菌株的生長特征及產酸能力采用LB培養基活化優勢產酸菌株,按1%接種量接種菌懸液至產酸菌液體培養基,在30 ℃、120 r/min 條件下振蕩培養24 h,每隔1 h測定培養液OD600,以不接種菌懸液的產酸菌培養基為空白對照。

1.5 菌株形態學及理化鑒定菌落的大小、顏色、形狀等形態特征通過肉眼觀察;菌體微觀形態特征通過革蘭氏法染色在光學顯微鏡下觀察。菌株常規生理生化反應(VP試驗、甲基紅試驗、淀粉水解試驗、過氧化氫酶試驗、糖發酵試驗)參照伯杰氏細菌鑒定手冊的常規方法進行。

1.6 16S rDNA 序列測定和同源性比較以細菌基因組DNA為模板擴增16S rDNA,擴增采用一對通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′);PCR擴增條件:95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,35個循環;72 ℃ 1.5 min,72 ℃ 5 min。PCR 產物送上海生物工程有限公司完成測序,測序結果通過GenBank Blast 進行相似性分析,用Glustal W 1.8軟件包中的鄰接法(neighbour-joining)構建系統發育進化樹。

1.7 氟污染土壤修復試驗采用盆栽試驗,選用塑料小盆,每盆裝土500 g,按照表1方案分別加入氟化鈉溶液,加水保持60%田間持水量,平衡30 d后種植1年生茶梅苗,每盆種3株;微生物修復是在植物種植前噴灑優勢產酸菌培養液,每組設3次重復。修復30 d后取土壤和植物樣品測全氟含量。

表1 試驗設計方案Table 1 Test design scheme

1.8 樣品測定植物樣品清洗后置于100 ℃恒溫烘箱干燥至恒重,用粉碎機粉碎、過40目標準篩,裝入密封袋中并貼上標簽,置于冰箱保存備用。土壤樣品除雜后置于室外陰涼通風口,經自然風干后,研磨過60目標準篩,裝入密封袋中并貼上標簽,置于冰箱保存備用。應用氟離子選擇電極法測定土壤、植物樣品全氟含量[15-16]。

1.9 數據分析利用統計分析軟件Origin 8.0 對試驗數據進行分析和處理。

2 結果與分析

2.1 優勢產酸菌的分離與鑒定

2.1.1菌株篩選。經富集、劃線分離、滴加酚紅變色等途徑篩選分離純化得到13株產酸細菌,按序號從Cs-1依次命名至Cs-13。將13株菌株接種至產酸菌液體培養基培養24 h后測定培養液pH,其中菌株Cs-3培養液pH最低,由初始值6.5下降至3.88,選擇作為下階段試驗用菌株。

2.1.2菌株形態與生化鑒定。 菌株Cs-3 在產酸菌固體培養基上培養24 h后,菌落呈白色圓形,不透明,表面凸起光滑,邊緣整齊;經革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察其細胞呈球形狀,無芽孢,革蘭氏陰性;甲基紅、淀粉水解、過氧化氫酶、糖發酵試驗呈陽性;莢膜、VP、明膠液化試驗呈陰性。

2.1.3菌株的16S rDNA測序結果。菌株Cs-3提交GenBank獲得的登錄號為MG755257,其16S rDNA序列經Blast比對分析,與GenBank中葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)的16S rDNA序列具有99%同源性,構建的系統發育進化樹如圖1所示。結合菌株的形態和理化特征,初步鑒定Cs-3菌株為沃式葡萄球菌(Staphylococcuswarneri),命名為StaphylococcuswarneriCs-3。

2.2 Cs-3菌的生長特征及產酸性能Cs-3菌的生長曲線如圖2所示,在24 h內,菌株的生長經歷了3個時期:在0～4 h為生長延滯期,該階段菌株生長緩慢;>4～14 h為對數生長期,菌株生長迅速;>14～24 h菌株生長處于穩定平衡期,這一階段菌株繁殖速度下降,菌量趨于穩定。菌株培養液的pH隨生長周期的變化而變化,在12 h內,菌株培養液pH從5.68下降至3.62;在>12～24 h,菌株培養液pH維持在3.60左右,未發生明顯變化。經接種量、溫度、轉速等條件優化后,Cs-3菌株培養液pH最低可降至3.51。

2.3 氟污染土壤修復結果

2.3.1茶梅苗對氟的吸收累積特征。盆栽條件下種植茶梅苗30 d后,其根、莖、葉等部位的氟含量如圖3所示。從圖3可以看出,隨著土壤外加氟離子濃度的增大,茶梅苗根、莖、葉的氟含量增加。在試驗濃度范圍內,植物體內氟含量從大到小依次為葉、莖、根,在不添加Cs-3培養液的前提下,A6組茶梅苗葉片部位的氟含量最高,為811.97 mg/kg;添加Cs-3培養液后(A7組),茶梅苗葉片氟含量增加至989.68 mg/kg,兩組茶梅苗葉片的氟含量分別是對照組的17.6和20.8倍;茶梅苗根部從土壤中吸收氟離子通過莖部向葉片轉移并富集。

為進一步說明茶梅苗對土壤氟的富集能力和吸收特征,分別計算茶梅苗根、莖、葉部位對氟的生物富集系數(BCF)以及莖葉對氟的轉運系數(TF),計算結果見圖4～5。以富集量最高的茶梅苗幼苗葉片為例,其對土壤中不同濃度氟的富集能力存在差異,在不添加產酸菌僅種植茶梅苗進行修復的情況下,低濃度氟污染組(A1、A2、A3)茶梅苗葉片對氟的生物富集系數為1.298～1.301,高濃度氟污染組(A4、A5、A6)生物富集系數僅為0.582～0.709,明顯低于低濃度組。茶梅苗莖葉對氟的轉運系數為3.68～7.87,其變化規律與生物富集系數基本一致,即低濃度組轉運能力相對較強,高濃度組轉運能力減弱。研究表明,茶樹類植物對氟的吸收存在低濃度主動、高濃度被動的情況,在高濃度污染下,氟會破壞茶樹的細胞結構從而影響其正常生長,茶樹根系對氟的吸收轉運受包含離子交換態氟含量在內的多種因素影響[17]。

圖1 基于16S rDNA序列構建的菌株Cs-3以及相關種、屬的系統發育進化樹Fig.1 Phylogenetic evolution tree of strain Cs-3 and related species and genera constructed based on 16S rDNA sequence

圖2 Cs-3菌的生長曲線及其產酸效果Fig.2 Growth curve of Cs-3 bacteria and its acid producing effect

圖3 茶梅苗根、莖、葉中水溶態氟含量Fig.3 Water soluble fluoride content of roots,stems and leaves of Camellia sasanqua seedlings

圖4 茶梅苗對氟的生物富集系數Fig.4 Biological concentration factor of fluoride in Camellia sasanqua seedlings

圖5 茶梅苗莖葉對氟的轉運系數Fig.5 Translocation factor of fluoride in stems and leaves of Camellia sasanqua seedlings

2.3.2修復前后土壤氟含量特征。采用修復前后土壤全氟去除量與初始量的比值計算土壤氟脫除率,結果見圖6。從圖6可以看出,低濃度污染組(A1、A2、A3)土壤氟脫除率為44.83%～59.09%;高濃度污染組(A4、A5、A6)土壤氟脫除率明顯降低,最高僅為37.24%。表現出茶梅苗受高濃度氟污染毒害,吸收累積能力下降,修復效率變差。

圖6 土壤氟脫除率Fig.6 Fluorine removal rate of soil

2.3.3產酸菌對修復效果的影響。以外加2 000 mg/kg氟污染土壤為研究對象,同等條件下種植茶梅苗,比較Cs-3培養液添加的作用效果,結果如圖7所示。從圖7可以看出,添加了Cs-3培養液的A7組茶梅苗葉片中的氟濃度為989.68 mg/kg,較未添加Cs-3培養液的A6組茶梅苗葉片中的氟濃度(811.97 mg/kg)增加了21.89%;根部和莖部的氟濃度也分別增加了18.18%和29.35%。從土壤氟含量來看,在30 d修復期內,A6組土壤氟含量下降至1 395.76 mg/kg,脫除率為37.24%,而添加了Cs-3培養液的A7組土壤氟含量下降至897.50 mg/kg,脫除率增加至57.81%,土壤氟下降程度較茶梅苗單獨修復組更高。可見Cs-3培養液的添加有效促進了茶梅苗對氟的吸收,從而導致土壤氟含量下降,起到促進修復的作用。

圖7 產酸菌對氟污染土壤修復的影響Fig.7 Effect of acid-producing bacteria on fluorine contaminated soil remediation

3 討論

土壤氟的存在形態決定其對環境的危害程度,其中水溶態氟含量是影響植物吸收累積效果的重要因素。另外,不同植物對氟的吸收累積能力差別很大,該試驗選用的茶梅苗屬山茶科,文獻報道山茶科作物可暴露于高濃度的氟環境下正常生長代謝,并在葉片中高度富集氟[18],不同觀賞性茶樹樹葉中的氟含量在790～3 060 mg/kg[7],茶樹類植物不同組織對氟的吸收累積能力也不同。該試驗中,茶梅苗根、莖、葉中的氟含量隨著土壤氟離子濃度的增加而增加,在茶梅苗單獨修復30 d的前提下,葉片最高累積量為811.97 mg/kg,高于莖部和根部的累積量,不同部位的累積規律與文獻報道的分布規律(葉片>吸收根>主根>莖)[19]略有不同,這可能是在不同氟離子濃度及其他環境條件下,植物體內可能存在不同的適應和轉運機制。在該試驗研究條件下,茶梅苗莖葉的氟轉運系數為3.68～7.87,氟離子易從根部吸收,然后轉運到莖部,再到葉片富集積累,但是隨著土壤氟濃度的增加,茶梅苗對氟的富集和轉運能力下降。

在添加Cs-3培養液作用下,茶梅苗各部位對土壤氟的累積量和土壤氟脫除率均表現為最高,可能存在以下兩方面原因:一是Cs-3培養液的pH為3.51,添加到土壤中可增強土壤酸性,而易被植物吸收的水溶態氟含量又與土壤pH呈顯著正相關[20],植物在酸性條件下具有更強的富集轉移氟的能力[21];另一方面,Cs-3菌株在發酵過程中產生大量低分子有機酸,它們可通過與氟的競爭吸附[22]或絡合作用改變土壤氟的存在形態,進而改變土壤氟的生物有效性[23],更利于被植物吸收利用,這一點在重金屬污染土壤修復中應用較多。

4 結論

(1)實驗室分離得到一株具有產酸能力的Cs-3菌株,最佳產酸條件下,培養液最低pH為3.51。經過對Cs-3菌的形態特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,初步鑒定為沃式葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)。

(2)茶梅苗對氟污染土壤具有良好的修復作用,土壤氟脫除率最高為59.09%。茶梅苗不同部位對氟的吸收累積能力表現為葉>莖>根,在土壤氟添加量為0～2 000 mg/kg,茶梅苗單獨修復30 d時,葉片最高氟含量為811.97 mg/kg;且隨著土壤氟含量的增加,茶梅苗各部位的氟累積量升高。

(3)添加Cs-3培養液能有效促進茶梅苗對土壤氟的富集吸收,在外加2 000 mg/kg氟污染水平下,Cs-3與茶梅苗聯合修復效果最好,葉片氟累積量從811.97 mg/kg增加至989.68 mg/kg;修復30 d后,土壤氟濃度下降至897.50 mg/kg,下降程度較茶梅苗單獨修復組更高。