偏振光聲成像技術的研究與發展*

劉劼 陳偉 楊秋琳 穆根 高昊 申滔 楊思華 張振輝?

1)(華南師范大學信息光電子科技學院,廣州 510006)

2)(華南師范大學生物光子學研究院,激光生命科學教育部重點實驗室,廣州 510631)

生命體是一個高度有序化的結合體,細胞和組織的基本生物過程本質上受生物分子構象和排列的控制,其中生物分子的排列有序度、取向、螺旋和折疊等特征與生物組織的生理功能密切相關.偏振成像可以獲取生命體或材料的微觀排列結構,取向和手性等構象信息,在材料學檢測,生物影像領域得到了廣泛的應用,但其成像深度和解析偏振信息等方面存在困難.光聲成像以電磁波為激發源,以超聲為載體傳遞信息,成為一種結合光學高對比度和超聲深穿透性的無損成像方式,利用擴散光子激發目標并檢測由此產生的聲響應可以打破光學擴散極限的限制.近年來一種偏振光聲成像技術作為偏振光學成像的補充,在保證成像深度的同時可以獲取介質的三維偏振信息,為組織的偏振測量提供了一種有效而直接的策略,預示著在生物成像和材料檢測兩方面的巨大潛力.本文總結了偏振光聲成像技術的發展,首先闡明了偏振光聲成像的物理原理和技術方法,隨后從生物組織成像和納米材料檢測兩個應用領域展開介紹了偏振光聲顯微成像、偏振光聲計算層析成像和偏振光聲納米材料分子成像的相關研究進展,并且簡要論述了偏振光在組織中傳播時因顆粒尺寸、密度、排列等因素產生的退偏情況,最后展望了偏振光聲成像的應用前景.

1 引言

生物醫學影像領域起始于1895 年德國物理學家威廉·倫琴發現X 射線[1],此后的一個世紀里得到了迅速的發展.在現代生物醫學中,影像技術為科學家提供了可視化的手段用以揭示生物體內部的復雜結構以及動態的生理過程,在臨床上影像技術進一步輔助了醫生對病灶區域的醫療診斷,在基礎研究上,生物醫學影像為我們提供了用于探究生物體微觀層面生理機制的有利手段.影像技術主要分為臨床類及基礎研究類型,前者主要包括磁共振成像[2]、X 射線計算機層析成像[3]、超聲成像[4]、光學相干層析成像[5]和基于光學方法的內窺鏡檢查等,后者則主要囊括共聚焦、多光子、偏振光、超分辨熒光顯微鏡[6,7]、電子顯微鏡、質譜成像、熒光層析成像、生物發光、光聲成像等多種光學顯微鏡成像技術[8-10].

生物體是由生物分子有序組裝而成的復雜系統,其分子取向、排列、螺旋和折疊等特征決定了生物組織的功能和性能.例如,大腦中的不同區域具有不同的構象,與其神經活動密切相關[11];皮膚和心肌中的膠原纖維具有一定的方向性,與其力學特性密切相關[12];細胞分裂時微管、DNA 等分子的有序排列和組合,與其遺傳信息表達與傳遞密切相關.生物體結構的有序性是生命現象的基礎,一旦發生異常,往往導致疾病的產生.例如,腫瘤細胞基質中膠原纖維的含量和有序性與腫瘤的侵襲性密切相關[13];神經退行性疾病和動脈粥樣硬化中出現的淀粉樣斑塊,其分子具有明顯的各向異性特征[14,15];此外,肝纖維化、心肌壞死等疾病都伴隨著組織結構各向異性的改變[16].因此,監測生物體結構有序性的動態變化對于揭示生物發育規律和實現疾病早期診斷具有重要意義.

光是一種電磁波,其具有4 個基本的特性:強度、波長、相位和偏振.偏振是光的矢量特性,它反映了光的振動方向,用于研究揭示介質中的矢量信息.偏振光學成像技術是一種利用偏振光與介質相互作用來探測介質微觀結構特征的方法.這種方法可以利用入射偏振光與介質中亞波長尺度的各向異性結構(如散射粒子)產生的退極化效應,來獲取介質的光學性質和結構信息.然而,在生物醫學應用中,偏振光學成像技術還面臨著很多挑戰,因為光在生物組織傳播存在較強的散射[17],這會導致信號的衰減和退極化,限制了成像深度和分辨率,增加了數據分析的復雜度.例如:偏光顯微鏡和偏振相干拉曼散射成像只能對薄切片或透明培養細胞進行成像[18];穆勒矩陣成像技術雖然可以快速獲取塊狀樣品表面或內部的結構信息,但它是將一定厚度的樣品視為一個二維傳輸矩陣,在深度方向上不能區分不同層次的結構特征;偏振熒光成像雖然可以利用熒光標記物來增強信號和選擇性,但是熒光標記物靶向分子存在非剛性和不均勻性,并且還可能對生物分子產生毒性或干擾作用[19].因此,需要發展新的成像技術,能夠以清晰、靈敏、可量化的參數來描述深層介質中微觀結構的各向異性特征,實現在體三維、高對比度、多信息成像生物組織.

光聲成像技術(PA)是一種利用光致超聲現象進行生物醫學成像的方法,其發展始于1880 年Alexander Graham Bell 的光聲效應的發現[20].20世紀末,光聲成像技術隨著激光器和高靈敏度的聲學傳感器的出現而得到快速的推進,其在生物醫學影像領域表現出了巨大的潛力.光聲成像技術的原理是,當組織受到電磁波的輻射時,基態的電子會躍遷到激發態,然后通過非輻射躍遷的方式釋放熱量導致組織溫度升高,使組織發生熱彈性膨脹效應產生壓力波,其在2—3 個波長范圍內會衰減消失[21],但同時伴隨產生的超聲波會傳播到組織表面被探測器捕獲,最后通過算法重建反演出組織內部的吸收或彈性信息.光聲成像技術將光轉化為光聲信號(即聲波)在成像深度上有所突破.聲波是一種機械波,其在生物組織的散射程度遠低于相同傳播距離下光的散射程度(2—3 個數量級),同時聲波在生物組織中的傳播速度遠小于電磁波[22],因此光聲成像技術與傳統光學成像相比具有更深的檢測深度和三維體成像能力,與傳統聲學成像技術如超聲成像相比,具有高分辨率高對比度的優勢[23-25].在臨床醫學和生物醫學影像領域上填補了“超聲看不清,光學看不深”的臨床檢測空白.近年來,光聲成像技術迅速發展,根據成像方式的不同可以分為光聲計算層析成像[26]、光聲顯微成像和光聲內窺成像[27-29];根據檢測參數的不同可以分為光聲吸收成像[24,29,30],光聲血氧、血流、氧代謝成像[31,32],光聲彈性成像[33,34],光聲非線性參數成像[21,35](如圖1 所示).

圖1 光聲成像技術概述[24,26-28,34,36-38]Fig.1.Schematic diagram of the photoacoustic imaging[24,26-28,34,36-38].

之上的光聲成像技術通常將生物組織的吸收系數視為各向同性,即視為標量,丟失了各向異性生物分子與偏振光相互作用的特征信息.基于分子對光的矢量吸收,一種偏振光聲成像近幾年被提出并快速發展,其繼承了光聲成像的三維深層成像能力和偏振光學相應的各向異性組分分析能力,可以對組織深層偏振信息進行提取并無標記表征其相關分子構象的特征.本文將從偏振光聲成像的原理,技術發展兩個方面闡述該技術的發展歷程.

2 偏振光聲成像原理

當入射光照射分子或發色團時,從基態|φa〉到激發態|φb〉的量子躍遷過程是電磁波與分子的電、磁偶極躍遷矩之間的共振耦合.分子的空間固定躍遷偶極矩(TDMs)是電躍遷偶極矩(ETDM)Uab和磁躍遷偶極矩(MTDM)Mabφb〉的組合,這里的和分別為電偶極子和磁偶極子.電子的躍遷概率一方面取決于電磁波的頻率是否等于躍遷偶極矩的振蕩頻率,另一方面取決于躍遷偶極矩與電矢量E、磁矢量B之間的夾角.引入分子與電磁波電場E和磁場B之間相互作用的哈密頓算符·B,并合理地忽略高階相互作用項,根據量子力學中的費米黃金法則,發色團的光吸收強度可以表達為[39]

其中,E和B分別為電場強度和磁感應強度,分別是沿E和B方向的單位向量,E·,B·,γ 是特定的分子常數.非螺旋結構的分子或無手性的發色團在線性偏振光照射下其磁偶極矩與電磁波的相互作用可以忽略,此時發色團的光吸收主要由電躍遷偶極矩貢獻.在這種情況下,等式(1)右側的第2 項、第3 項和第4 項可以忽略.如圖2(a)所示,展現了單個分子的矢量吸收模型,其中單個分子(或單個生色團)的躍遷電偶極矩U具有特定的方向,當發色團與線偏振光相互作用時,光吸收概率與電矢量和躍遷偶極矩之間的夾角θ相關:

圖2 分子矢量吸收原理示意(a) 單個發色團各向異性吸收示意圖,E,U 和M 分別為入射光的電矢量,發色團的電躍遷偶極矩(ETDM)和磁躍遷偶極矩(MTDM),θ 為E 與U 之間的夾角,Δθn 為單分子躍遷偶極矩取向的擺動范圍;(b),(c) 分別表示線偏振光和圓偏振光激發各向異性分子的電子能級躍遷示意圖Fig.2.Schematic of molecular vector absorption principle:(a) Schematic diagram of anisotropic absorption of a single chromophore,E, U and M are the electric vector of incident light,the electric transition dipole moment(ETDM) and the magnetic transition dipole moment(MTDM) of the chromophore,respectively,and θ is the angle between E and U,Δθn is the swing range of the single molecule transition dipole moment orientation;(b),(c) schematic diagrams of electronic energy level transitions of anisotropic molecules excited by linearly polarized light and circularly polarized light,respectively.

等式(2)表明吸收概率與角度θ之間滿足余弦平方的函數關系,當入射光的電矢量方向與電躍遷偶極矩方向一致時,電子吸收光子發生躍遷的概率最大[40],如圖2(b)所示.而對于光的電矢量方向垂直于電躍遷偶極矩方向時,則情況相反,此時吸收概率最小.電子吸收概率受到角度θ的調制,并且單分子躍遷偶極矩取向的擺動角 Δθn越小調制程度越大,即分子結構的各向異性越明顯,Δθn等于180°,代表此分子對光的吸收特征為各向同性.另一方面,具有手性的光學活性分子或發色團與圓偏振光相互作用時,電磁感應電荷同時產生線性電荷位移和電荷旋轉,即一個光學活性躍遷實際上將有一個允許的電躍遷偶極矩(即線性電荷位移)和一個允許的磁躍遷偶極矩(電荷旋轉).分子的圓二向色性與所謂的旋轉強度有關[41],旋轉強度R0是電躍遷偶極矩和磁躍遷偶極矩點乘的虛數部分.

式中,ηth,Γ和I0分別表示光熱轉換效率、Grüneisen 參數和局部光通量.μα(|φa〉→|φb〉) 表示吸收系數,它滿足如下公式:

通過考慮線偏振光與單軸分子的相互作用,μα(|φa〉→|φb〉)可以表示為

進一步分析在激發光照射范圍內存在多個分子吸收體的情況,如圖3 所示,這時躍遷電偶極矩是多個分子躍遷電偶極矩Un的矢量和,即,躍遷電偶極矩的分布具有一個彌散角Δθ.當激光照射范圍內分子取向一致的情況下Δθ越小,表現出更強的各向異性吸收特性,當分子取向有序度越差時Δθ越大,則各向異性吸收特性越弱.為了研究激發區域內多個分子的線二向色性,分別定義了平行躍遷偶極矩矢量i和垂直躍遷偶極矩矢量j.Un表示單個分子的躍遷偶極矩,所以平行和垂直方向的平均躍遷偶極矩可以表示為[42]

圖3 光激發范圍內多個躍遷電偶極矩分布示意圖,Δθ 代表平均躍遷電偶極矩彌散角度,Δθ 越大代表多分子排列有序度越小[42]Fig.3.The schematic diagram of the distribution of multiple transition electric dipole moments in the photoexcitation range,where Δθ represents the average diffusion angle of the transition electric dipole moment,and the larger Δθ represents the smaller order of the multiple molecules[42].

其中,使用μ//,μ⊥分別表示平行躍遷偶極矩方向和垂直躍遷偶極矩方向上的光吸收系數,因此,μ//,μ⊥可以分別表示為

則(4)式可以表示為[43,44]

3 偏振光聲成像技術的發展與分類

偏振光聲成像技術2012 年首次被提出后沉寂了一段時間[45],直到2018 年Lihong V.Wang 團隊和華南師范大學邢達/楊思華團隊[43,44]針對偏振光聲的采集方式和提取參數進行了開拓式的研究,分別提出了偏振光聲計算層析成像和定量式偏振光聲顯微成像技術,之后的幾年該技術得到了光聲成像領域的重視,相繼有香港城市大學王立代團隊和香港理工大學賴溥祥團隊[46]合作,于2019 年提出了一種光纖延時的偏振光聲成像系統,實現了單次掃描即可重建偏振光聲圖像;2021年,中國科學院深圳先進技術研究院劉成波團隊[47,48]發展了一種手持偏振光聲探測成像方法,演示了大視野量化各向異性生物組織結構;2021年,華盛頓大學的Song Hu 團隊[49]發表了利用剛果紅染色實現了偏振光聲技術可視化腦中淀粉樣蛋白的研究;2022年,北京協和醫學院楊軍團隊[50]報道了偏振光聲成像三維定量化分子排列各向異性度結果,同年華南師范大學楊思華/邢達團隊提出了光聲穆勒矩陣成像技術[39],建立了單分子矢量吸收模型,實現了同時量化各向異性度、分子取向和分子手性的能力;此外,蘇州大學的劉莊團隊[51]也開展了關于無背景磁控偏振光聲分子成像的相關研究.2023年,華南師范大學張振輝/石玉嬌團隊[42]再次演示了偏振光聲成像定量識別膠原纖維各向異性度用于精準評估皮膚燒傷程度的工作,同時提出了角分辨偏振光聲顯微鏡,用于二維材料晶軸取向的識別[52];韓國Chulhong Kim 團隊[53]針對偏振光聲成像準確提取分子取向進行了詳細的研究,理論得出最少需要3 束偏振態不同的激發光重建出分子的取向,實際成像中4—6 束偏振態不同的激發光能更準確反演分子取向;偏振光聲成像技術的進展的歷程如圖4 所示.

圖4 國內外偏振光聲成像技術的發展Fig.4.Development of polarized photoacoustic imaging technology at home and abroad.

偏振光聲成像能特異性地檢測生物分子或材料的構象、排列信息,使其在生物組織成像和納米材料檢測兩個領域具有應用潛力,本文將從生物成像和納米材料檢測兩個方面介紹偏振光聲技術的最新發展.

3.1 偏振光聲技術-各向異性生物組織成像

3.1.1 偏振光聲顯微成像

2012年,Lihong V.Wang 團隊[45]首次提出了一種基于偏振光聲技術的線二向色性光聲顯微鏡系統,在其實驗光路的搭建中,利用半波片(HWP)以及偏振分束器(PBS)實現了兩束正交偏振光的生成,兩束激光經光電調制器(EOM)的調制后實現了兩束激光的能量和延時調控,對阿爾茲海默癥小鼠腦組織切片進行了成像.基于淀粉樣蛋白的線二向色性特征并結合剛果紅對淀粉樣蛋白進行特異性標記,以532 nm 的脈沖激發光進行偏振光聲成像,驗證了偏振光聲成像能高對比提取矢量吸收物質的線二向色性特征,結果如圖5(a)—(g)所示.在該工作中,作者使用兩束電矢量相互垂直的線偏振光激發樣品,分別得到水平偏振激發產生的光聲信號P1和垂直偏振激發產生的光聲信號P2,定義線二向色性:

圖5 線二向色性光學分辨率光聲顯微鏡及實驗結果[45,49](a) 線二向色性光學分辨率光聲顯微鏡(DOR-PAM)系統原理圖;(b) 腦切片的光學顯微鏡照片,用剛果紅(CR)和中性紅(NR)雙染色APP/PS1 小鼠腦切片;(c) 圖(b)中藍色區域的放大圖和箭頭分別表示CR 染色的淀粉樣斑塊和NR 染色的背景細胞;(d),(e) 在兩種正交偏振光照射下獲得的DOR-PAM 圖像;(f),(g) 分別為圖(d)和圖(e)的總和差值,圖(g) 中的差異檢測消除了非二向色背景,并突出了淀粉樣斑塊的線二向色性對比;(h) 二向色性-血氧血流多參數雙對比PAM 原理圖,框形插圖給出了為同時二向色性和多參數PAM 成像設計的激光激勵方案,其中AOM 為聲光調制器,FC 為光纖耦合器,PM-SMF 為保偏單模光纖,BPF 為帶通濾波器,DM 為二向鏡,EOM 為電光調制器,OL 為物鏡,CL 為矯正鏡,UT 為超聲波換能器,WT 為水箱,DAQ 為數據采集,水平/垂直極化;(i)—(k) 10 月齡的小鼠活體腦多參數PAM 圖像,包括活體鼠腦血紅蛋白的總濃度(CHb)、血紅蛋白氧飽和度(sO2)和血流成像;(l) 二向色性PAM 圖像顯示剛果紅(CRD)染色的淀粉樣斑塊和血管壁沉積物的分布;(m) 圖(l)中矩形框區域放大圖;(n) 圖(l)中矩形框區域共聚焦圖像,比例尺為200 μmFig.5.The DOR-PAM system and experimental results[45,49]:(a) Schematic of the DOR-PAM system;(b) optical microscopic photo of the brain section;(c) close-up of the boxed area in Fig.(b),the blue and black arrows indicate the CR-stained amyloid plaque and the NR-stained background cells,respectively;(d),(e) the DOR-PAM images acquired with each of the two orthogonally polarized optical irradiations,respectively;(f),(g) the summation and subtraction of Fig.(d) and Fig.(e),respectively,the differential detection in Fig.(f) eliminates the non-dichroic background and highlights the dichroic contrast of the amyloid plaque;(h) schematic of dual-contrast PAM,the boxed inset illustrates the laser excitation scheme designed for simultaneous dichroism and multi-parametric PAM,where AOM is the acousto-optic modulator;FC is the fiber coupler,PM-SMF is the polarization-maintaining single-mode optical fiber,BPF is the bandpass filter,DM is the dichroic mirror,EOM is the electro-optic modulator,OL is the objective lens,CL isthe correction lens;UTis the ultrasonic transducer,WTisthe water tank,DAQ isthedataacquisition,H/Vpol,horizontal/vertical polarization;(i)-(k) multi-parametric PAMimagesof a 10-month-old APP/PS1mousebrain in vivo,including the CHb,sO2,and blood flow speed;(l) dichroism PAM image showing the distribution of CR stained amyloid plaques and deposits in the vessel wall;(m) close-up of the boxed area in Fig.(l);(n) confocal image of the boxed area in Fig.(l).Scale bars:200 μm.

2021年,華盛頓大學Song Hu 團隊[49]沿用上述偏振顯微方法并結合光聲血紅蛋白濃度、血氧飽和度、血流成像技術針對剛果紅染色后的小鼠腦進行了多參數成像,結果如圖5(h)—(n)所示,該工作推動了偏振光聲顯微成像對活體樣品的研究.但上述兩個工作,其激發光只有2 束電矢量正交的線偏振光,不足以量化目標樣品的線二向色性.基于此,2018 年華南師范大學楊思華/邢達團隊[43]提出了一種斯托克斯矢量表示方式的偏振光聲顯微鏡(PPAM).其原理與實驗結果如圖6 所示,該工作中作者利用4 束電矢量相差45°的線偏振光定量化樣本結構排列的各向異性度(線二向色性).其借用光學中用斯托克斯矢量描述激光偏振態的表示方式:

圖6 定量式偏振光聲顯微鏡的原理裝置和實驗結果[43](a) 分子矢量吸收原理示意;(b) DOA 值與偏振光聲信號調制強度的關聯;(c) PPAM 裝置圖;(d) PPAM 三維成像螳螂蝦復眼的各向異性特征Fig.6.Theoretical setup and experimental results of a quantitative polarized photoacoustic microscopy(PPAM)[43]:(a) Schematic diagram of molecular vector absorption principle;(b) the correlation between the DOA value and the modulation intensity of polarized photoacoustic signals;(c) PPAM device diagram;(d) the anisotropic characteristics of the compound eyes of praying mantis and shrimp in PPAM three-dimensional imaging.

其中IH和IV分別表示為水平線偏振態以及垂直方向的線偏振光分量,IP和IM分別表示為45°以及-45°下的線偏振光分量,IR和IL分別表示右旋以及左旋圓偏振光分量.描述光的線偏振度的參數可以定義為

由于光聲信號(即超聲波)的線偏振度的描述方式與(1)式和(2)式具有相似性,因此生物分子的各向異性度可以被描述為

實驗層面,該工作通過對兩種各向異性度不同的樣品聚氯乙烯(PVA)以及聚乙烯醇(PVC)在二維平面下的DOA 成像,證實了DOA 參數量化樣品分子排列各向異性度的能力,實驗中直觀地對兩種材料的各向異性度DOA 進行量化展示.除了在二維平面下的各向異性度檢測,作者在三維空間下基于PPAM 對蝦姑復眼各向異性進行檢測.實驗中展示了PPAM 對蝦姑復眼的三維空間下的偏振光聲成像圖,其中在深度0.4—1.0 mm 處的R1-7細胞DOA 較高,此外實驗進一步分別在460,520以及580 μm 的深度下對R1-7 的各向異性度進行了量化的檢測.結果在3 種不同深度下的R1-7 細胞所展示的DOA 存在差異,這一結果在過去非定量檢測的偏振光聲顯微鏡中是難以實現的.相比傳統光學偏振顯微鏡,定量檢測的偏振光聲顯微鏡提高了活體成像的深度.相比非定量檢測的偏振光聲顯微鏡技術,其對各向異性度的量化能夠提供更多的生物組織信息,同時使各類生物組織各向異性特征得到更精確的表征.

基于上述工作原理,科研工作者們又相繼提出了更精確的各向異性提取方法,分子取向重建原理并完善發展了偏振掃描系統.Wang 等[50]提出了一種高次諧波的光聲信號檢測的偏振光聲顯微成像技術,偏振光聲顯微鏡,使用高次諧波方法能夠在二維和三維空間下同時適用,克服了上述定量式偏振光聲無法在三維成像中量化各向異性和檢測光軸的取向.該工作中分析了激光穿過多層各向異性物質的情況,既定1/2 波片的旋轉頻率為f,則第一層各向異性物質產生的光聲信號交流部分(矢量吸收導致的光聲信號)的振蕩頻率等于2f,而由于第一層各向異性吸收的影響使得第二層的激光通量不再保持不變,而是一個滿足振蕩頻率為2f的參量,所以第二層各向異性吸收導致的光聲信號的震蕩頻率將變為4f,以此類推于激光穿越到n層各向異性物質將會產生對應的頻率為2nf的高頻震蕩信號.因此,頻率2nf的缺失可以用來區分第n層的各向異性和各向同性物體,另外通過高次諧波的初始相位可以用來檢測n層的光軸,并通過其強度來表征第n層的各向異性.為了驗證提出的方法,實驗通過設計的雙重聚焦型偏振光聲顯微鏡分別在2D 和3D 各向異性體模上進行成像,其結果如圖7 所示,A,B,C,D,E 是在3 個各向異性樣品的不同位置上選擇的5 個代表性像素.A,D,E 分別是從第1 層、第2 層和第3 層各向異性樣品上的非重疊區域中選擇的.B 和C 分別來自第2 層和第3 層線性偏振器上的重疊區域.

圖7 高次諧波的偏振光聲信號檢測技術和實驗結果[50](a) 線性偏振激光在不同層產生的光聲信號,黃色箭頭表示激光的電矢量方向,白色箭頭表示光軸的方向;(b) 三維各向異性樣品照片;(c) 在非重疊區域的歸一化光聲振幅;(d) 在重疊區域的歸一化光聲振幅;(e) 在非重疊區域的歸一化光聲信號振蕩的頻域分布;(f) 重疊區域的歸一化光聲信號振蕩的頻域分布Fig.7.High order harmonic polarized photoacoustic signal detection technology and experimental results[50]:(a) Photoacoustic signal generated by the linearly polarized laser at different layers,the yellow arrow indicates the polarization angle of the laser,and the white arrow indicates the orientation of the optical axis;(b) 3D anisotropy phantom;(c) normalized photoacoustic amplitude at the non-overlapping area;(d) normalized photoacoustic amplitude at the overlapping area;(e) spectrum of the normalized photoacoustic amplitude at the non-overlapping area;(f) spectrum of the normalized photoacoustic amplitude at the overlapping area.

在偏振光聲系統和分子取向提取方面,香港城市大學王立代團隊和香港理工大學賴溥祥團隊[46]合作提出了一種基于保偏光纖和激光分束的線性偏振光聲顯微鏡成像技術.該實驗的實驗光路中初始激光經過兩個偏振分束器以及半波片將激光分為三束偏振態不同的激光,這種由同一束激光分離出的激光具有很高的同步性,能夠有效降低激光的能量波動,提高成像質量.這項技術通過3 束偏振角分別為0°,45°,90°的激光同時入射在樣品上產生光聲信號,來提取DOA 參數,簡化了激發光的數量,并成功提取了分子排列取向的分布,其實驗裝置和結果如圖8 所示.分子取向方位角θ:

圖8 光纖延時單次掃描的偏振光聲技術[46](a) 光纖延時線二向色性系統示意圖;(b) 電矢量方向為0°,45°和90°的三束線偏振光分別激發得到的光聲圖像;(c),(d) 計算得到的線二向色性圖像和分子取向圖像Fig.8.Polarized photoacoustic technology for fiber delay single scan[46]:(a) Schematic of the dual-fiber single-shot dichroism ORPAM system;WT,water tank;(b) PA images of three linear polarizers excited with polarized light at 0°,45°,and 90°;(c),(d) calculated dichroism image and polarization angle of the three linear polarizers.

通過(16)式計算出的分子取向角度范圍為-45°—45°,而不是-90°—90°(或0°—180°),這是由關于0°中心對稱的數據引起的數據簡并,這源于光聲信號幅度的標量特性,因此,兩個取向相互垂直的分子不能被區分.

從單分子躍遷偶極矩物理模型出發通過斯托克斯矢量的表示方法,Zhang 等[39]再次提出了光聲穆勒矩陣成像的概念,并解決了分子取向簡并的問題,實現了0—180°分子取向成像.為完整表征各向異性分子矢量吸收特征,該工作中引入6束偏振態分別為0°,90°,45°和-45°線偏振光和左、右旋圓偏振光作為激勵光束,并將樣品視為三維光學吸收矩陣.與將樣品塊視為二維光傳輸矩陣的光學穆勒矩陣不同,所提出的偏振光聲矩陣成像技術能夠提供具有明確物理意義的樣品內在偏振特性的三維解析成像.在偏振光聲矩陣成像理論模型中,6 束激發光的極化狀態可以被描述為斯托克矢量通過依次激發樣品得到不同偏振激光束下產生的光聲信號幅值,偏振光聲矩陣可以表示為

其中SPA和MPA分別表示偏振光聲矩陣和樣品的光吸收矩陣,MPA包含了樣品完備的吸收特征,通過計算可以表示為

結果表明,MPA的第1 行表示受激分子在不同偏振光束下的確切吸收信息.

其中,PAH,PAV,PAP,PAM,PAR,PAL分別表示偏振態為0°,90°,45°,-45°的線偏振激光,右旋和左旋圓偏振激光激發產生的光聲信號振幅.根據(19)式,可以定義一個反映分子總吸收的參數:

分子或分子集團的有序度變化反映了它們之間的相互作用、結構和功能的特性.本項目從MPA提取了定量反映組織中分子排列有序程度的各向異性度(degree of anisotropy,DOA):

DOA 的范圍為0—1.當DOA=1時,光吸收是完全各向異性的,表明所有受激分子的躍遷偶極矩一致.在這種情況下,可以觀察到相應的光聲信號幅值隨激發激光束偏振態的明顯變化.當分子隨機分布時,DOA=0,對應的光聲信號幅度不會隨線偏振激發光的偏振角發生變化.進一步地,受激發分子的躍遷偶極矩(OTDM)取向也可以通過矩陣MPA巧妙地得到:

根據(22)式計算出的OTDM角度范圍為-45°—45°,如圖9(a)的Ⅰ區域所示,而不是-90°—90°(或0°—180°),這是由關于0°中心對稱的數據引起的數據簡并,這源于光聲信號幅度的標量特性,因此,圖9(a)所示的U1和U2兩個方向相互垂直的躍遷偶極矩不能被區分.為了提高分辨躍遷偶極矩的范圍,通過PAV和PAH之間的關系識別OTDM 取向的象限,若PAV＞ PAH時,則OTDM 應該出現在45°—135°的象限內,故在原始OTDM補償90°,將OTDM的取向范圍角度從-45°—45°擴展到-45°—135°,如圖9(c),(d)所示.最后,將所有角度增大45°,以實現0°—180°的OTDM 成像.

圖9 實現0—180°分子躍遷偶極矩取向[39](a) OTDM 分布示意圖,E 和U 分別為入射光的電矢量和電躍遷偶極矩;(b) 計算機模擬的虛擬樣品OTDM 分布設置示意圖,這些樣品的DOA 值都設置為1;(c) 根據(21)式計算模擬得到的OTDM 成像結果;(d) 消除簡并效應后得到的OTDM 成像結果Fig.9.Measurement of 0—180° molecular transition dipole moment orientation[39]:(a) OTDM distribution diagram,E and U are the electric vector and electric transition dipole moment of incident light respectively;(b) schematic diagram of OTDM distribution settings for virtual samples simulated by computer,with DOA values set to 1 for these samples;(c) calculate the simulated OTDM imaging results according to Eq.(21);(d) the OTDM imaging results obtained after eliminating the degeneracy effect.

除了分子的空間排列信息外,手性也是自然界和生命中分子最基本的特征之一.表征分子手性的圓二色性也可以通過矩陣MPA計算得到:

因此,通過建立矢量吸收矩陣偏振光聲成像理論模型,該工作獲取生物組織中分子各向異性度DOA、分子空間取向OTDM 及反映分子手性CD 三個定量參數表征分子構象.之后該課題組還利用DOA參數量化了燒傷初始時刻的皮膚中膠原纖維的有序性,實現對燒傷嚴重程度的準確評估[42].Park等[53]針對偏振光聲成像準確提取分子取向進行詳細的研究,得到分子取向的數學表達式:

其中,N為下標對應的偏振光聲信號的個數,i和j為信號的元素指標.當?a=?b時,求解分子取向角的線性偏振光束的最小數目為3個,例如,30°,60°和150°.此外,來自生物組織的PA 信號通常較弱,容易受到環境信號或干擾的影響,考慮到生物組織的弱各向異性吸收特征實際成像中4—6 束偏振態不同的激發光能更準確反演分子取向,其結果如圖10 所示.

圖10 偏振光聲成像分子取向的準確性與激發光電矢量數目的關聯[53](a) 線二向色性光聲顯微成像系統裝置示意圖(DS-PAM),其中FC 為光纖準直器,L 為透鏡,BS 為分束器,PBS 為偏振分束器,RS 為旋轉臺,UST 為超聲波換能器,WT 為水箱,AMP 為放大器,PD 為光電探測器,PC 為電腦,DAQ 為數據采集;(b) 交叉導線的照片;(c) 常規光聲圖像;(d) 根據激發光偏振狀不同得到的一系列圖像;(e) 分子取向方位角;(f) 線二向色性圖Fig.10.The correlation between the accuracy of molecular orientation in polarized photoacoustic imaging and the number of excited photoelectric vectors[53]:(a) The DS-PAM system configuration,FC is fiber collimator,L is lens,BS is beam splitter,PBS is polarizing beam splitter,RS is rotary stage,UST is ultrasonic transducer,WT is water tank,AMP is amplifier,PD is photodetector,PC is personal computer,DAQ is data acquisition;(b) photograph of crossed wires,the red box indicates the FOV for DS-PAM;(c) conventional PAMAPimage;(d)series ofimages according to the polarization states;(e) azimuth and(f) dichroism mapping accordingto(i)-(iv)thenumber ofanglesapplied.

基于偏振光聲顯微成像技術提取樣品各向異性度、分子取向和手性特征的原理和方法已經被證實,相信隨著偏振光聲顯微系統的完善,偏振光聲提供的生物組織各向異性特征參數將在多種疾病病理研究和早期診斷發揮作用.

3.1.2 偏振光聲計算機層析成像技術

傳統光聲斷層掃描技術與光聲顯微鏡及光聲內窺鏡相比發展時間最早[9],相較于光聲顯微鏡,光聲層析掃描在實驗裝置上主要的不同在光路末尾的透鏡以及傳感器的排列,光聲顯微鏡在光路末尾通常采用凸透鏡聚焦光束,提高局部小區域的成像對比度,光聲計算層析成像在光路末尾通常采用凹透鏡實現光束擴束,提高成像范圍.在傳感器的設計上,光聲顯微鏡由于成像區域較小,對超聲傳感器數量上的要求相對較低,相反對于傳感器的性能參數有較高的要求;光聲斷層掃描成像由于成像范圍大,使用一個傳感器的接收范圍無法完全覆蓋,因此多個傳感器的不同排列使光聲斷層掃描成像擁有更多的可能.

2018年,基于偏振光聲成像,Lihong V.Wang團隊[44]提出了對各向異性敏感的偏振光聲計算層析成像技術(DS-PACT).相比傳統的光聲計算層析成像,偏振光聲計算層析成像實現了對樣品各向異性程度和分子取向的檢測.實驗中,傳感器的排列沿樣本在半徑5 cm 處呈環狀分布,這種環狀的傳感器陣列中的元件呈弧形,使成像平面上產生了19.8 mm 的軸向焦距.實驗裝置如圖11(a)所示.

圖11 線二向色性光聲計算層析成像系統與實驗結果[44](a) 線二向色性光聲計算層析成像(DS-PACT)裝置圖;(b) 以0.625 Hz 的幀率獲得常規PACT 圖像序列,使入射光的偏振率旋轉為11.25°/s;(c) 歸一化PA 振幅的時間的函數;(d) 傅里葉光譜位于0.0625 Hz 的峰值對應于由調制極化引起的交流光聲信號;(e) 重建的DS-PACT 圖像;(f) 顏色編碼的分子取向方向角度圖;(g) 無散射介質的樣品照片,樣品包含兩塊牛腱,它們相互垂直放置;(h)PA 振幅的調制深度隨著散射介質厚度D 的變化曲線,高達15 mm,紅色實線表示與測量數據的指數擬合,黑色虛線表示噪聲水平;(i) 常規PACT 圖像;(j) 使用DSPACT 的振幅圖像;(k) 兩塊牛肌腱的方位角圖Fig.11.Linear dichroic photoacoustic computed tomography system and experimental results[44]:(a) Experimental setup of linear dichroism-sensitive photoacoustic computed tomography(DS-PACT);(b) a sequence of conventional PACT images is acquired at a frame rate of 0.625 Hz,rotating the polarization of the incident light at 11.25°/s;(c)normalized PA amplitude as a function of time at one representative spatial point.PA(t) is normalized with respect to its average;(d) Fourier spectrum of PA(t).The peak located at 0.0625 Hz corresponds to the alternating PA signals due to the modulated polarization;(e) DS-PACT image reconstructed by the amplitude of the lock-in term;(f) color-coded orientation angle map of the sample,which is reconstructed from the phase of the lock-in term;(g) photograph of the sample without any scattering medium.The sample contains two pieces of bovine tendon,which are placed perpendicular to each other;(h) modulation depth of the PA amplitude acquired with increasing thickness D of the scattering medium,up to 15 mm,the red solid line indicates the exponential fit to the measured data.The black dashed line represents the noise level;(i) conventional PACT images;(j) amplitude images using DSPACT;(k) orientation angle maps of the two pieces of bovine tendon.

后續實驗中對PVA 材料薄膜以及對離體的牛腱進行了成像檢測,證實了偏振光聲計算層析成像技術能在6 個傳輸平均自由程內表征生物樣品的各向異性特征.

2022年,Ren 等[47,48]設計了一種手持的偏振光聲斷層掃描探頭,加速了偏振光聲計算層析成像技術在臨床應用領域的實際落地,實驗裝置和結果如圖12 所示.該手持探頭可大致分為偏振光學系統、偏振光聲信號采集系統以及整體外殼.偏振光學系統為一系列光學鏡片組成,作為改變激光偏振態的半波片通過帶有刻度可調整角度的波片架固定,實現手動調整激光偏振態.偏振光聲信號采集系統為128 個線陣排列的超聲換能器,實現偏振光聲信號的采集.整體外殼由3D 打印技術打印完成,偏振光學系統與偏振光聲信號采集系統呈45°角組裝到一起,從而達到較好的光激發和聲探測效率.

圖12 手持式偏振光聲計算機斷層掃描系統與結果[47](a)手持式偏振光聲探頭裝置示意,UT 為超聲換能器,HWP 為半波片;(b) 校準裝置的照片;(c) 不同偏振方向的PVA 和PVC 的光聲成像;(d) PVA 和PVC 的偏振光聲信號受激發光電矢量方向的調制曲線;(e) 小鼠腿(上)和 牛肌腱(下)的照片;(f) 小鼠 腿(上)和牛肌腱(下)的HP-PACT 圖像,激發光電 矢量方 向為0°(水平)和90°(垂直);(g) 小鼠腿(上)和牛肌腱(下)線二向色性結果圖Fig.12.Handheld polarized photoacoustic computed tomography system and results[47]:(a) Handheld polarized photoacoustic probe,UT is ultrasound transducer,HWP is half wave plate;(b) photograph of the calibration setup;(c) PAI of the PVA and PVC with different polarizations;(d) modulation curve of polarized photoacoustic signals in PVA and PVC excited by photoelectric vector direction;(e) photograph of the mouse leg(upper) and bovine tendon(lower);(f) HP-PACT images of mouse leg(upper) and bovine tendon(lower) with the polarization of the excitation light being 0°(horizontal) and 90°(vertical);(g) dichroic imaging of mouse leg(upper) and bovine tendon(lower) lines.

為進一步對該裝置的準確性進行探究,該團隊首先對該探頭的偏振光學系統進行了校驗,將激光通過偏振光學系統垂直入射于偏振測量儀上進行校驗,隨后為驗證偏振光聲信號采集準確性,選擇具有強各向異性的聚乙烯醇式偏光片(PVA)和各向同性的深色塑料片(PVC)進行實驗,該探頭在兩項實驗中擁有出色的表現,展現良好的準確性.隨后團隊進行仿體實驗,將PVC 和光軸方向為0°,45°,90°,135°的PVA 浸入散射介質中檢測以及對層疊的不同深度且光軸不同的PVA 進行深度測試,最后團隊對離體牛腱進行生物組織測試.實驗結果驗證了該裝置具有良好的成像質量以及準確性.

偏振光聲計算層析成像相比于偏振光聲顯微成像技術可以實現更快的采集速度,同時避免了復雜的多束激光耦合的問題,或由于掃描機械抖動帶來系統誤差,使偏振光聲成像技術推上臨床成為可能,但同時應該認識到由于偏振光聲計算層析成像采用大光斑激發,其激發區域較大,導致產生的偏振光聲信號是多個分子的共同貢獻,所以該成像模式下各向異性度的準確性會下降,較適用于簡單規則的各向異性樣品的檢測.

3.2 偏振光聲技術-納米材料構象特征檢測

基于偏振光聲技術對不同各向異性介質有特異性反映的性質,偏振光聲技術也被嘗試應用于材料的性能測試.其中手性是物體在鏡像情況下不相同的一種對稱性,一個手性物體的兩個鏡像僅在空間排列上有所不同,這導致它們與相反手性的圓偏振光的相互作用不同,折射率和吸收差異分別反映了材料的光學活性和圓二色性.2017年,Benedetti 團隊[54]成功利用光聲檢測技術精確測量了納米螺旋中的圓二色性.由于散射和衍射干擾,通過傳統光學途徑測量樣本的二向色特性存在細節不足的缺點.因此該團隊嘗試通過偏振光聲顯微鏡對納米螺旋簇的圓二向色性進行表征.通過比較光學和光聲技術,全光測量受到高衍射效應的影響,此外,在樣品面積減小的情況下,空區傳輸阻礙了場的純度.光聲成像技術則通過測量與螺旋結構完全相關的獨立于散射的吸收來獲得了樣品的純凈和精確的圓二向色性特征,其系統與結果如圖13所示.

2019年,Petronijevi?團隊[55]就金屬-聚苯乙烯(SNSA)超表面的手性特性進行偏振光聲檢測.他們利用光聲光譜來表征右旋和左旋圓偏振的不同吸收,給出材料的圓二色性作為直接結果,實驗結果與數值計算結果吻合較好.為了判斷光聲信號能否反應納米結構構象特征,團隊對比測量了蒸發過程中沉積在聚苯乙烯二維陣列附近的同一基板上的平坦金屬膜的光譜以及SNSA 的光譜.結果顯示所有樣品在633 nm 處都有顯著的增強的光聲信號,團隊進一步選擇該波長進行圓二色性表征,實驗裝置和結果如圖14 所示.作者展示了納米球光刻結合傾斜金屬沉積方法產生的超表面的手性檢測方法.應用光聲技術表征了3 種不同金屬覆蓋的聚苯乙烯納米球在633 nm 處的圓二色性(CD),覆蓋Au 和Cr 的樣品顯示出手性行為,而覆蓋Ag 的樣品顯示出正入射的CD,具有本征手性特征.通過這種優化的設計,可以獲得高效的納米級圓偏振檢測.

圖14 偏振光聲檢測金屬-聚苯乙烯(SNSA)超表面的手性特性[55](a)—(c) 分別為Au-半納米殼陣列、Cr-半納米殼陣列、Ag-半納米殼陣列的場發射掃描電子顯微成像(FESEM);(d) 納米殼幾何參數和蒸發角度草圖;(e) 手性-PA 設置裝置示意,插圖為入射模式;(f) Au 沉積前后旋轉四分之一波片得到的光聲信號幅值變化趨勢;(g) 不同入射角下3 個樣本CD 值的變化;(h) Au-SNSA在最大CD 條件下吸收密度的分布,最大吸收密度在金納米的邊界上Fig.14.Chiral properties of metal polystyrene(SNSA) metasurfaces detected by polarized photoacoustic detection[55]:(a) Au-SNSA,(b) Cr-SNSA,and(c) Ag-SNSA and(d) sketch of the geometric parameters and the evaporation angle;(e) schematic diagram of chiral PA setting device,illustration:incidence mode;(f) the amplitude variation trend of photoacoustic signals obtained by rotating a quarter wave plate before and after Au deposition;(g) changes in CD values of three samples under different incident angles;(h) the distribution of absorption density of Au SNSA under maximum CD conditions is shown,with the maximum absorption density at the boundary of gold nanoparticles.

各向異性二維材料(如黑磷、二硫化錸等)因其低對稱的晶格結構,不僅表現出高遷移率和高開關比,在光學、熱學和電學等方面還具有獨特的各向異性.這些各向異性特征為新型光電器件的研發提供了額外的自由度,可以用來開發偏振敏感光探測器、薄膜偏振器等.而其各向異性特征及應用與晶軸取向高度相關,目前晶軸取向的光學檢測技術主要有角分辨拉曼光譜、偏振反射技術和偏振透射技術等,其中激發波長、樣品厚度以及襯底性質等均會對檢測結果產生影響.基于偏振光聲原理以及各向異性二維材料的光吸收特性,2023 年華南師范大學石玉嬌/張振輝團隊[52]進一步發展了角分辨偏振光聲顯微鏡,通過分析偏振光聲信號幅值與入射光偏振方向和晶軸取向之間的夾角的函數關系,實現了對黑磷晶軸取向的通用性精準檢測.檢測結果不受厚度、激發波長以及封裝層影響,其系統和不同厚度黑磷樣品的晶軸取向檢測結果如圖15所示.

圖15 角分辨偏振光聲技術檢測二維材料的晶軸取向[52](a) 角分辨偏振光聲顯微鏡系統示意圖,插圖為黑磷樣品的光學照片;(b) a1,a2,a3 和a4 為4 個采樣點的晶軸(扶手椅型)取向檢測結果Fig.15.Angle resolved polarized photoacoustic technology for detecting the crystal axis orientation of two-dimensional materials[52]:(a) The diagram of the angle-resolved polarized photoacoustic microscopy(AnR-PPAM) system and the illustration is the optical photo of black phosphorus;(b) a1,a2,a3,and a4 are the crystal axis(armchair type) orientation detection results of the four sampling points.

在生物分子影像領域,蘇州大學劉莊團隊[51]提出了一種基于磁響應的 Fe3O4@Au 磁性納米棒磁控無背景偏振光聲成像技術.該技術通過對光場方向的調控能夠使這種納米棒的表面激發出等離激元,以及對光聲信號產生進行可逆性的調控.入射光電矢量方向與納米棒長軸平行時可以獲得更大的吸收概率,激發更強的等離激元,垂直則相反,所以可以通過施加磁場使本來無序排列的納米棒呈現有序排列,進而調節激發光電矢量的方向可以實現對體內納米探針光聲信號的有效調制.該工作提出了在交變磁場下同時進行PA 成像的FFT 加權成像技術,其通過采集一段時間內的PA 圖像并提取出每個像素的PA 強度.利用快速傅里葉變換將時域信號轉換為頻域信號,在頻譜空間內,周期性信號容易被識別為尖峰,并與靜態和隨機噪聲區分開來.最后,通過對頻域峰值強度進行逆傅里葉變換恢復信號,可以生成無背景的PA 圖像,從而完全去除噪聲,大大提高了的靈敏度和特異性,其原理和結果如圖16 所示.

圖16 基于磁響應納米探針的偏振光聲無背景成像[51](a) 磁控偏振光聲無背景成像的原理示意圖;(b) 光激發下不同共振波長納米棒的電場分布,比例尺為20 nm;(c) 靜脈腫瘤無背景偏振成像示意圖,注入Fe3O4@Au NRs;(d) 傳統光聲成像和偏振光聲無背景成像結果Fig.16.Polarized photoacoustic background free imaging based on magnetic responsive nanoprobes[51]:(a) Schematic diagram of the principle of magnetic controlled polarized light acoustic background free imaging;(b) electric field distribution of orientated nanorods under light excitation at resonant wavelength.Scale bars:20 nm;(c) background free polarization imaging schematic of venous tumors,injection Fe3O4@Au NRs;(d) control photoacoustic imaging and polarized photoacoustic imaging have no background imaging results.

偏振光聲成像技術由于避免了光散射的影響,只依賴于光吸收,所以在納米材料構象特征的檢測上具有獨特優勢.生物外源造影劑相比于生物內源分子具有更強的矢量吸收特點,可以得到更好的對比度成像,但其缺失了生物功能參數.

4 結論

光與生物組織的相互作用是人們所感興趣的一方面,主要的一個動機是對渾濁生物物體進行成像的潛力.光在生物組織中的偏振特性取決于多種因素,包括入射偏振態、散射體的大小和形狀、散射體的濃度.鑒于許多生物細胞、細胞器和生物大分子的形狀接近于球體與橢球體,生物組織通常被建模為均勻球形顆粒的集合,瑞利和米氏理論或其組合是計算組織散射特性的基礎[56].對于線偏振光來說,去偏振很大程度上取決于散射體的大小和密度[57,58],而在具有不同尺寸的散射混合體中進行傳播時,去偏振行為由較小的散射體主導[59,60].另一方面生物組織中也存在各向異性的結構,比如心肌和肌腱,都含有豐富的膠原蛋白,由于分子各向異性而具有固有的線性雙折射,此類樣品中入射偏振態的變化是由于組織雙折射以及散射去偏振造成的.而本文介紹的偏振光聲成像,其模式為偏振光激發和聲檢測,相比于偏振光學成像減小一半的光程,使得其成像深度更深,特別針對活體淺表的偏振檢測尤為適合.

總之,本文首先從單分子矢量吸收的理論模型闡明了偏振光聲成像的物理機制,總結了提取樣品各向異性度,取向和手性的技術方法的發展歷程.從生物組織成像和納米材料檢測兩個應用領域展開介紹了偏振光聲顯微成像、偏振光聲計算層析成像和偏振光聲納米材料分子成像的相關研究進展.偏振光聲成像技術是近十年才出現的新型技術,相比于傳統的偏振光成像技術,其具備兩個特別優勢.一是物理機制簡單明了,只源于目標物的吸收系數,二是具備傳遞目標物深層結構的構象信息能力,因而近幾年得到更廣泛的關注.偏振光聲成像技術的物理方法已經得到明確,將來的突破方向應著眼于二維材料或生物體發育、病變的應用研究,例如二維材料的分子取向和其光電特性的關聯,生物分子排列取向信息和復雜疾病病理之間的關聯.更快、更穩定的成像系統有待進一步完善,提取特征參量的算法有待進一步發展.偏振光聲成像技術集合了偏振光學成像的極化信息提取和光聲成像的特異性深層成像的能力,為材料和生物基礎研究提供多功能參數.