保健食品中B族維生素的快速分析方法研究

周新星 張玲玲 周曉瑩 施莎敏 任亦洋 賈福懷

摘 要：目的：建立同時分析煙酰胺、維生素B1、維生素B6、維生素B2且前處理簡單的快速檢測方法。方法：樣品用0.1%三氟乙酸溶液超聲提取，C18色譜柱分離，以0.1%三氟乙酸-乙腈為流動相梯度洗脫，紫外檢測器檢測。結(jié)果：方法對4種B族維生素的分離效果明顯，分離度全部超過1.5，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈直線回歸，相關(guān)系數(shù)大于0.999 5，檢測結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法一致。結(jié)論：該方法操作更便捷，分析速度快，靈敏度和準(zhǔn)確度高，適用于保健食品中4種B族維生素含量的檢測。

關(guān)鍵詞：B族維生素；高效液相色譜法；保健食品；同時分析

Study on Rapid Analysis Method of B-Group Vitamins in Health Food

ZHOU Xinxing1， ZHANG Lingling1*， ZHOU Xiaoying2， SHI Shamin1， REN Yiyang1， JIA Fuhuai1

（1.Ningbo Yufangtang Biotechnology Co.， Ltd.， Ningbo 315012， China; 2.Ningbo Yuyi Biotechnology Co.， Ltd.， Ningbo 315012， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid method for the simultaneous analysis of niacinamide， vitamin B1， vitamin B6 and vitamin B2 with simple pretreatment. Method： The samples were extracted with 0.1% trifluoroacetic acid solution by ultrasonication， separated on a C18 column， eluted with 0.1% trifluoroacetic acid-acetonitrile as the mobile phase gradient， and detected by ultraviolet detector. Result： The method was effective for the separation of the four B vitamins， and the separation degree was more than 1.5 for all of them. The standard curve showed linear regression， and the correlation coefficient was more than 0.999 5， and the detection results were in agreement with the national standard method. Conclusion： The method is more convenient to operate， fast to analyze， with high sensitivity and accuracy， and is suitable for the determination of the contents of the 4 B vitamins in health food.

Keywords： B vitamins; high performance liquid chromatography; health food; simultaneous analysis

近些年，人們越來越意識到B族維生素是人體不可缺少的重要營養(yǎng)素，市場上也出現(xiàn)越來越多的多種維生素片、復(fù)合維生素片以及維生素類功能飲料等保健食品。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中測定B族維生素含量的方法大多數(shù)前處理復(fù)雜、耗時長且成本高[1-4]。因此，研究出能同時快速準(zhǔn)確分析保健食品中煙酰胺、維生素B1、維生素B6、維生素B2且前處理簡單的檢測方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集市場上暢銷的3種含多種B族維生素的保健食品，作為實(shí)驗(yàn)1號、2號、3號樣品。

煙酰胺（批號為100115-202005，純度為99.9%）、維生素B1（批號為100390-202107，純度為97.4%）、維生素B6（批號為100116-201906，純度為99.9%）和維生素B2（批號為100369-201905，純度為98.2%），均由中國食品藥品檢定研究院出品；乙腈（HPLC）、鹽酸（GR），國藥集團(tuán)；三氟乙酸（HPLC），阿拉丁；超純水，由Arium Comfort I純水超純水一體機(jī)制得，其電阻率不大于18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀（DAD檢測器），美國安捷倫公司；METTLER TOLEDO XS205DU 電子天平，梅特勒-托利多集團(tuán)；KH-250DB數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Arium Comfort I純水超純水一體機(jī)，賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于適宜容量瓶中，加入鹽酸溶液（1+1）2 mL并超聲溶解，然后用水定容搖勻，配成100 μg·mL-1的維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別精密稱取20 mg煙酰胺、維生素B1及維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品于適宜容量瓶中，加0.01 mol·L-1鹽酸溶解并定容搖勻，配成濃度為400 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密移取每種標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用0.1%三氟乙酸稀釋定容，從而得到煙酰胺濃度100 μg·mL-1、維生素B1濃度50 μg·mL-1、維生素B6濃度50 μg·mL-1、維生素B2濃度50 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品處理

精密量取混合均勻的液體樣品1 mL或精密稱取研磨混勻的固體樣品0.1 g于適宜的容量瓶中，加適量的0.1%三氟乙酸溶液，超聲提取5 min，待樣液冷卻后定容搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流動相：A為0.1%三氟乙酸溶液，B為乙腈，梯度洗脫見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

根據(jù)維生素B1、維生素B6、煙酰胺、維生素B2的理化性質(zhì)[5]，對不同提取方法和提取溶劑進(jìn)行研究，選擇出最佳提取條件。

2.1.1 提取方法

以1號樣品為試樣，考察了在室溫下用0.1%三氟乙酸溶液超聲提取5 min、手搖振蕩提取5 min和搖勻靜置提取5 min 3種不同提取方法對4種B族維生素提取效果的影響。結(jié)果顯示，對于維生素B2，超聲提取的提取率明顯高于其他兩種方法；對于其他3種B族維生素，3種提取方法的提取率比較接近。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用超聲提取。

2.1.2 提取溶劑

以1號樣品為試樣，考察了純水、鹽酸、0.1%三氟乙酸溶液的提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，純水對維生素B6的提取效果明顯比其他兩種溶劑差；鹽酸對煙酰胺的提取效果明顯比其他兩種溶劑差；對于其他兩種B族維生素，0.1%三氟乙酸溶液的提取效果與其他兩種溶劑相近。因此，在接下來的實(shí)驗(yàn)中都選用0.1%三氟乙酸溶液作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

本次實(shí)驗(yàn)選擇三氟乙酸水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫，提高分離效果，避免離子對試劑損害色譜柱的同時也大大降低了檢測成本。

2.2.2 色譜柱的選擇

通過實(shí)驗(yàn)對比了兩款性能較優(yōu)的C8柱與C18柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過梯度洗脫程序優(yōu)化后C8柱未能將維生素B1和維生素B6分離開，而且維生素B2出峰位置處有梯度引起的基線波動，會對結(jié)果造成影響，而C18柱的分離效果良好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用C18柱。同時本實(shí)驗(yàn)也比較了25 ℃、35 ℃及40 ℃柱溫下4種維生素色譜峰的分離效果，結(jié)果表明柱溫改變對分離效果幾乎無影響，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用25 ℃柱溫。

2.2.3 檢測波長的選擇

各種維生素最大紫外吸收波長都不相同，故本實(shí)驗(yàn)對4種維生素在波長200～450 nm進(jìn)行紫外圖譜掃描。在兼顧每種B族維生素最大紫外吸收波長和靈敏度的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)采用紫外280 nm檢測，4種B族維生素的分離效果良好。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取適量1.3.1項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和1.3.2項(xiàng)下的試樣溶液，根據(jù)1.3.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。樣品色譜圖中B族維生素的理論塔板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，均達(dá)到基線分離，因此本方法能進(jìn)行定性定量分析。

2.3.2 線性關(guān)系及檢出限實(shí)驗(yàn)

取1.3.1項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1%三氟乙酸水溶液稀釋制備成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)1.3.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到4種維生素的回歸方程。煙酰胺為y=3.273 4x+0.555 8，r=0.999 8；維生素B1為y=16.145x-4.039 7，r=0.999 8；維生素B6為y=33.789x+0.32，r=0.999 9；維生素B2為y=58.074x-5.227，r=1.000 0。用3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限，煙酰胺的檢出限為0.3 μg·mL-1，其他維生素均為0.2 μg·mL-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，煙酰胺在5～50 μg·mL-1呈直線回歸，其他維生素在2.5～25 μg·mL-1呈直線回歸，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，檢出限低，所以本方法能進(jìn)行定量分析。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

（1）重復(fù)性。準(zhǔn)確稱取6份實(shí)驗(yàn)1號樣品，根據(jù)1.3.2項(xiàng)的方法進(jìn)行供試液的配制，并根據(jù)1.3.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行檢測，測得各B族維生素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.41%～1.79%，表明該方法精密度高。

（2）重現(xiàn)性。不同實(shí)驗(yàn)員（n=3）用本方法對實(shí)驗(yàn)1號、2號、3號樣品進(jìn)行獨(dú)立測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.11%～1.96%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取6份實(shí)驗(yàn)1號樣品，每2份為1組，共3組，再分別加入低（樣品濃度80%）、中（樣品濃度100%）、高（樣品濃度120%）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)1.3.2項(xiàng)的方法進(jìn)行供試液的配制，并根據(jù)1.3.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行檢測，計算得到回收率（表2）。測得各B族維生素平均回收率在98.1%～99.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.29%～2.06%，由此可見該方法回收率好。

2.4 實(shí)際樣品的檢測

用本方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法對實(shí)驗(yàn)1號、2號、3號樣品進(jìn)行測定，并比較檢測結(jié)果（表3）。本方法和國標(biāo)方法測定結(jié)果偏差較小，均在允許范圍內(nèi)，因此本方法可用于保健食品中B族維生素的檢測。

3 結(jié)論

本文建立了同時測定保健食品中B族維生素的方法，經(jīng)過色譜條件的優(yōu)化，成功實(shí)現(xiàn)了煙酰胺、維生素B1、維生素B6、維生素B2的基線分離。本方法操作流程簡便，前期處理工作量少，實(shí)用性較高，能在25 min內(nèi)完成上述4種維生素的同時檢測，能為保健食品中B族維生素的同時分析提供實(shí)際幫助。

參考文獻(xiàn)

[1]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中煙酸和煙酰胺的測定：GB 5009.89—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[2]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B1的測定：GB 5009.84—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[3]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B6的測定：GB 5009.154—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[4]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B2的測定：GB 5009.85—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[5]吳景，邢書霞，曹進(jìn).食品中維生素檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015（8）：2881-2889.