基于網絡藥理學和分子對接技術探究健脾化濕方治療潰瘍性結腸炎的作用機制

徐張揚，蔣蓓爾，萬雨，閔天驕，劉光盛，何穎

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis， UC）是一種慢性、病程較長且反復發病的腸道性炎癥疾病，其發病機制目前尚未明確，臨床表現主要有腹瀉、大便黏稠、大便膿血等［1］。目前，UC 的臨床治療目標主要是控制或緩解癥狀，促進黏膜愈合，減少復發。現有治療藥物主要包括5-氨基水楊酸、類固醇、免疫抑制劑等。雖然中重癥患者使用激素類藥物起效快、療效佳。然而，患者在治療過程中易產生耐藥、藥物依賴和機會性感染［2-3］，且對于輕癥患者尤其是肝腎功能欠佳患者而言，藥物產生的不良反應可能大于治療效果［4］。因此，越來越多的患者和醫生考慮替代醫學方案治療UC。在北美和歐洲地區，有21%～60%的臨床醫生采用替代醫學方案治療UC［5］。而中醫治療UC 具有獨特的優勢，可根據UC 的不同發病機制進行多層次、多角度的辨證論治。中藥尤其是中藥復方具有多靶點、整體調節等優勢，其形式靈活多樣，預后效果好，是替代醫學方案的首選［6］。

中醫將UC 歸于“痢疾”“泄瀉”“便血”等范疇，主要有“脾虛濕熱”“肝旺脾弱”“脾胃虛弱”“脾腎陽虛”等癥候［7］。本課題組基于中醫基礎理論，自擬了具有健脾止瀉、緩解脾胃虛弱的健脾化濕方，該方由山藥、陳皮、焦山楂、炒薏苡仁4 味藥食同源的中藥組成。本課題組前期實驗證明，健脾化濕方能有效改善UC 小鼠腸道黏膜屏障功能，抑制白細胞介素（interleukin， IL）-1b、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor， TNF-α）的表達。然而，健脾化濕方治療UC 的分子機制尚未明確。由于中藥具有多成分、多靶點、多通路的作用功效特點，網絡藥理學可基于大規模的生物信息學和化學信息學數據庫，高效篩選和預測中藥復方藥物靶點，預測中藥有效成分與相關靶點的作用機制。分子對接技術能夠模擬復方中單一藥物與靶點之間的相互作用，揭示藥物與靶點的結合模式，從而彌補傳統藥理學不能系統闡述中藥治療UC 的缺點［8］。目前，已有研究開展如黃岑湯、葛根岑連湯、半夏瀉心湯等多種傳統中藥方劑治療UC 的網絡藥理學研究［9］。本研究采用網絡藥理學方法系統分析健脾化濕方治療UC 的作用機制，并采用分子對接技術加以驗證，為健脾化濕方治療UC 以及后續實驗提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 健脾化濕方活性成分及作用靶點篩選 分別以健脾化濕方所包含的單味中藥（山藥、山楂、陳皮、薏苡仁）為檢索詞，通過中藥系統藥理數據庫和分析平臺（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php， TCMSP）檢索其活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30% 和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件［10-11］，并增加未納入數據庫但文獻中已經報道具有生物活性和藥理作用的成分。利用Drugbank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）和TCMSP 收集活性成分相對應的作用靶點信息。

1.2 UC 潛在靶點預測 以“ulcerative colitis”為檢索詞，通過Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、DisGeNet（https：//www.disgenet.org/）數據庫，獲取UC 相關靶點，以“relevance”（相關性）>5 作為篩選指標，對數據庫內相關疾病靶點進行篩選，并應用于與健脾化濕方活性成分對應靶點的交集運算中，得到健脾化濕方治療UC 的潛在作用靶點。

1.3 “藥物活性成分-疾病-靶點”網絡互作圖構建及關鍵活性成分獲取 將上述得到的交集靶點和健脾化濕方活性成分導入Cytoscapev 3.7.2 軟件中，繪制健脾化濕方治療UC 的“藥物活性成分-疾病-靶點”網絡互作圖。隨后利用軟件中Centi-ScaPe 2.2 插件對網絡進行拓撲學分析，依據“Degree”值篩選出健脾化濕方治療UC 的關鍵活性成分。

1.4 蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建及核心靶點網絡構建 利用String 數據庫version 11.0（https：//www.string-db.org/）對交集靶點進行PPI 分析，設置物種為“homosapiens”，high confidence≥0.700。隨后利用Cytoscape 中的插件Cytohub 對PPI 網絡進行拓撲學分析，以“Degree”值為篩選依據篩選核心靶點，并繪制核心靶點網絡。

1.5 基因本體（gene ontology， GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）信號通路富集分析 首先通過R語言對交集靶點進行基因名稱的轉換，再利用Bioconductor（R） v3.8 對GO 和KEGG 信號通路進行富集分析，設定P<0.05，并將結果繪制成柱狀圖。

1.6 分子對接驗證 選取PPI 網絡圖和“藥物活性成分-疾病-靶點”網絡互作圖中Degree 值排名前5 位的核心靶點和關鍵活性成分進行分子對接驗證，靶點信息從PDB（http：//www1.rcsb.org/）數據庫中獲得，分別為腫瘤蛋白p53（TP53， PDB ID：1gzh）、腫瘤壞死因子（TNF， PDB ID： 1tnf）、原癌基因JUN（JUN， PDB ID： 2gmx）、蘇氨酸激酶1（AKT1，PDB ID： 3qkl）、白細胞介素6（IL-6， PDB ID： 7dc8），關鍵活性成分從Pubchem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取。使用Autodock Vina 2.4.6 進行分子對接，受體與配體之間的結合能力由能量打分函數來評估，其分值越小，表明受體配體之間結合能（binding energy， kJ/mol）越強。對接結果由熱圖進行展示，結合能<-37.67kJ/mol 的結構利用Pymol 2.0 進行可視化展示。

2 結果與分析

2.1 健脾化濕方關鍵活性成分 通過在線數據庫和文獻檢索等方式，依據OB 和DL 值進行篩選，共得到健脾化濕方有效活性成分36 個，其中山藥16 個，陳皮5 個，山楂6 個，薏苡仁9 個，以及對應的作用靶點122 個。通過在線數據庫，依據“relevance”進行篩選，共獲得UC 疾病靶點440 個。將二者進行韋恩圖分析后，共得到交集靶點75 個，結果見圖1。

圖1 藥物靶點和疾病靶點韋恩圖

2.2 健脾化濕方“藥物活性成分-疾病-靶點”網絡互作圖 利用交集靶點、藥物活性成分、疾病靶點構建“藥物活性成分-疾病-靶點”網絡互作圖，結果見圖2，圖2 中共包括98 個節點和254 條邊。根據Degree 值對藥物活性成分進行排序，Degree 值為網絡中某一節點與其他節點的連接數目，用于判斷該節點在網絡中的重要程度，節點的Degree 值越大表明其參與的生物功能越多，其生物學重要性越強。本研究中篩選出排名前5 位的關鍵活性成分分別為槲皮素、山奈酚、川陳皮素、薯蕷皂素、柚皮素。

圖2 “藥物活性成分-疾病-靶點”網絡互作圖

2.3 交集靶點蛋白質網絡互作圖（PPI）及核心靶點網絡 將獲得的75 個交集靶點導入String 數據庫進行蛋白質互作分析，物種選擇為“homo species”，靶點關聯的置信度為0.7，從而得到交集靶點的蛋白質網絡互作關系，見圖3。將蛋白質互作關系導入軟件Cytoscapev3.7.2 中，利用插件Cytohub，以“Degree”值為篩選依據，得出排名前10 位的交集靶點互作圖，并以此作為核心靶點網絡，結果見圖4。由圖4 可知，健脾化濕方可能通過作用于IL-6、TNF、AKT1、TP53、JUN、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor， VEGFA）、IL-1、CXC模體趨化因子配體 8（CXC chemokine ligand 8， CXCL8）、趨化因子配體2（C-C motif 2， CCL2）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2， PTGS2）等基因，從而發揮治療UC 的作用。

圖3 交集靶點蛋白互作網絡圖

圖4 核心靶點蛋白互作網絡圖

2.4 交集靶點GO 和KEGG 分析結果 利用R 語言對交集靶點進行GO 和KEGG 信號通路富集分析，共得到1 887 條GO 條目和135 條信號通路。依據P值大小，選取了排名前10 位的GO 條目和前20 位的KEGG 信號通路并以柱狀圖進行展示。見圖5。其中涉及的生物過程主要有活性氧代謝、氧化應激反應、細胞內化學應激反應等。由圖6 可知，交集靶點主要富集在流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、糖尿病并發癥AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 信號通路、缺氧誘導因子1信號通路等。以上結果與核心靶點相互印證，表明健脾化濕方可通過抗氧化應激和免疫調節治療UC。

圖5 交集靶點GO 生物過程分析

圖6 交集靶點KEGG 信號通路結果

2.5 分子對接結果 利用Auto Dock 4.2.6 將TP53、TNF、JUN、AKT1、IL-6 與槲皮素、山奈酚、川陳皮素、薯蕷皂素、柚皮素進行分子對接。對接結果見表1。健脾化濕方的核心成分與TP53、TNF、JUN、AKT1 和IL-6 的結合能均小于-25.08 kJ/mol。其中薯蕷皂素和AKT1、TNF、IL-6 具有較高的結合能力，結合能分別為-39.71、-45.56、-43.47 kJ/mol。另外，山奈酚與TNF（- 38.46 kJ/mol）、IL - 6（-38.87 kJ/mol），槲皮素與TNF（-38.04 kJ/mol）、IL-6（-38.87 kJ/mol），柚皮素與IL-6（-38.87 kJ/mol）均有較強的結合能力。通過Pymol 2.0 軟件，選擇與核心靶點蛋白結合能最低的藥效成分進行分子對接，并進行可視化分析，見圖7。分子虛擬對接結果表明，化合物均能與靶蛋白的氨基酸殘基形成氫鍵，穩定結合在靶蛋白的活性口袋中。其中，結合能最強的TNF-α 通過2 個氫鍵與薯蕷皂素上的LYS-98、GLU-116 相結合；IL-6 通過5 個氫鍵與槲皮素上的THR-33、HIS-56、PHE-298、LEU-100A、TRP-100C 相結合；AKT 通過1 個氫鍵與薯蕷皂素上的GLU-191 相結合。分子虛擬對接實驗結果驗證了網絡藥理學結果的可靠性。

表1 健脾化濕方5 種種主要成分和5 種核心蛋白的對接分數（kJ/mol）

圖7 分子對接3D 示意圖

3 討論

UC 是一種特發性、慢性的結腸黏膜炎癥性疾病，起于直腸，通常以連續的方式向近端延伸至部分或整個結腸［1,12］，其癥狀主要表現為膿血便、里急后重、腹痛、腹瀉等。中醫通常將UC 劃歸于“泄瀉”“大腸泄”“便血”“痢疾”“滯下”等范疇，其病因主要有感受外邪、飲食不節、正氣虛損、情志失調等。本研究涉及的健脾化濕方由山藥、陳皮、山楂、薏苡仁4 味藥食同源中藥材組成，具有益氣養陰、消積化滯、活血化瘀等功效，能夠緩解UC 所引發的脾胃虛弱、寒濕瘀積、氣血不暢等癥狀。本課題組前期建立UC 小鼠模型，在動物水平上證明健脾化濕方能夠通過抑制炎癥和增強腸上皮連接的穩定性緩解UC。基于此，本研究利用網絡藥理學與分子對接技術進一步探究該方治療UC 潛在的分子作用機制。

研究結果表明，槲皮素、山奈酚、川陳皮素、薯蕷皂素、柚皮素在健脾化濕方調控UC 的過程中起到了主要作用，但上述天然產物的含量需進一步實驗探究。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，具有抗糖尿病、抗阿爾茲海默病、抗腫瘤、抗流感病毒、抗關節炎等功效。林瑞等［13］發現膳食補充30 mg/kg槲皮素能夠抑制小鼠結腸組織中促炎因子的產生，如IL-17、IL-6、TNF-α，促進抑炎因子IL-10 的產生，緩解由硫酸葡聚糖鈉鹽（dextran sulfate， DSS）誘導的UC。此外，槲皮素還能夠增加結腸腸道益生菌（擬桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌）的數量，恢復腸道宿主-微生物的平衡關系；山奈酚同屬于黃酮類物質，具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種功效。Bian 等［14］發現，在腸道上皮-內皮細胞共培養模型中，80 μm 山奈酚可通過抑制核因子κB（NF-κB）信號通路激活，減輕1 μg/ml 脂多糖誘導的跨上皮電阻（TEER）降低和白細胞介素8（IL-8）過表達。

當結合能小于-17.78 kJ/mol 時，配體與受體之間存在一定的結合活性；當結合能小于-20.92 kJ/mol 時，配體與受體之間存在較好的結合活性；當結合能小于-29.30 kJ/mol 時，配體與受體之間具有較強的結合活性［15］。本研究分子對接結果顯示，健脾化濕方核心成分與核心靶點的親和力普遍較高。健脾化濕方核心成分槲皮素、山奈酚、川陳皮素、薯蕷皂素、柚皮素與IL-6 和TNF-α 均有較強的結合能力。進一步證明了健脾化濕方核心成分能夠與核心靶點相互作用緩解UC 癥狀，尤其是抗炎通路，結果與上述前人研究相互印證，同時與本課題組前期實驗結果一致，即健脾化濕方能夠通過抑制促炎因子或調節腸道菌群緩解DSS 誘導的UC。

本研究蛋白互作網絡圖的進一步分析結果顯示，促炎細胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1b、CXCL8、CCL2）和抑炎細胞因子IL-10 參與了腸內穩態和炎癥腸病相關的病理過程。IL-6 作為一種重要的炎癥介質，主要作用于間充質細胞和上皮細胞，通過募集多形核白細胞和巨噬細胞實現傷口愈合。在20 550 例克羅恩疾病患者、17 647 例UC 患者的全基因組Meta 分析中發現，通過阻斷IL-6 受體的治療方法可有效緩解腸道炎癥［16］。趨化因子作為一種分泌蛋白，主要用于調節免疫細胞在組織中的遷移和定位，在固有免疫反應中起到關鍵作用［17］。另外，相關研究顯示UC 患者結腸黏膜中CXCL8 和CCL2 表達水平顯著高于健康對照組［18］。TNF 作為炎癥性腸病致病機制中的另一個關鍵細胞因子，能夠誘導腸上皮細胞凋亡［19］。ICAM-1 為一種免疫球蛋白家族的跨膜糖蛋白，在發生局部炎癥的結腸組織中，在TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 等促炎因子的刺激下表達上調，可募集如巨噬細胞和粒細胞此類炎癥免疫細胞，發揮免疫調節作用［20-21］。

本研究生物過程富集結果顯示，健脾化濕方主要通過“活性氧代謝”“氧化應激”等過程緩解UC 癥狀。研究表明，胃腸道易受到活性氧（reactive oxygen species， ROS）的攻擊，ROS 的產生與消除之間的平衡變化引發的氧化應激反應是胃腸道黏膜疾病的重要發病機制之一［22］。局部炎癥發生時，中性粒細胞和巨噬細胞浸潤腸黏膜，釋放大量的ROS 和細胞因子，包括IL-6、IL-1b 和TNF-α，導致DNA、蛋白質和脂質氧化損傷，最終促進UC 的發展［23］。青蒿素能夠顯著抑制線粒體ROS 的產生并組織NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3NLRP3 炎癥小體的組裝與激活，從而減少IL-1b［24］。此外，生物過程富集結果還提示了“response to lipopoly saccharide”在治療中發揮的作用。脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成部分，在宿主-病原微生物和固有免疫系統的相互作用及炎癥性疾病的發生發展中起到關鍵作用［25］。脂多糖主要通過抑制腸道功能恢復和刺激促炎細胞因子的釋放來破壞腸黏膜屏障的完整性［26］。

本研究KEGG 信號通路富集結果則表明，免疫調節相關通路可能是健脾化濕方治療UC 的潛在通路，如TNF 信號通路、IL-17 信號通路、氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1， HIF-1）信號通路等。IL-17 是腸道炎癥發病機制中一個關鍵炎癥因子，在UC 患者的腸道黏膜中呈現上調的表達趨勢，其病情嚴重程度也與外周血中IL-17 表達水平呈正相關［27］。體外培育牛黃可能通過抑制IL-17/IL-17RA/Act1 通路，降低炎癥因子和趨化因子表達，從而改善DSS 誘導的UC［28］。

輔助性T 細胞17（thelper cell 17， Th17）被認為是UC 發病過程中的關鍵效應T 細胞，主要分泌IL-17 發揮腸道免疫調節。有關實驗表明，T 細胞的可塑性，尤其是Th1-Th17 軸和Th17-Treg 軸的可塑性在調節腸道免疫反應方面發揮著重要作用［29］。木樨草素可通過調節平衡Th1/Th2 和Th17/Treg 數量改善小鼠腸道炎癥并加速腸黏膜愈合［30］。HIF-1 是調節體內氧穩定性的重要轉錄因子。在生理狀態下，腸道黏膜中的HIF-1 表達較低或未表達。而在病理狀態下，如發生缺氧應激時，血液重新分配導致腸道血液灌流量急劇下降，引起局部缺血缺氧，從而導致HIF-1 的表達增加，并伴隨炎癥介質（如TNF-α 和IL-6）的增多，進而加速炎癥性腸病的發生［31］。黃岑湯能夠通過調節腸道菌群和抑制Ras-PI3K-Akt-HIF-1α、 NF-κB 信號通路緩解小鼠UC 癥狀［32］。因此，健脾化濕方可能通過抗炎、抗氧化和免疫調節途徑治療UC。

綜上所述，槲皮素、山奈酚、川陳皮素、薯蕷皂素和柚皮素可能是健脾化濕方的主要活性成分。IL-6、TNF、IL-1β、CXCL8、CCL2、IL-10 等細胞因子可能是健脾化濕方治療UC 的潛在靶點。此外，健脾化濕方可能通過調節免疫系統和炎癥相關通路中細胞因子的平衡，如IL-17 通路和Th17 細胞分化通路治療UC。本研究基于網絡藥理學和分子對接技術對健脾化濕方緩解UC 的分子作用機制進行了初步研究，為深入研究其分子機制提供了思路和方向。但本研究仍存在一定的局限性。一方面，本研究主要討論已經過實驗驗證和用于臨床治療的靶基因，可能會遺漏未經過實驗驗證的潛在治療靶點。另一方面，本研究缺少對潛在治療信號通路的實驗驗證。后續本課題組將結合前期動物實驗結果，從免疫調節和抑制炎癥著手，闡明健脾化濕方治療UC 的分子機制。