水中糞大腸菌群檢測方法研究

林娜

（浙江誠德檢測研究有限公司，浙江 寧波 315000）

0 引言

糞大腸菌群不僅存在于排泄物或人、動物腸道內，在各地水體環境中也檢測出糞大腸菌群，這種情況會導致整個水體環境被污染，誘發腸道病原菌感染[1]。做好糞大腸菌群的檢測工作，不僅能充分掌握監測水源區域糞大腸菌群的實際污染情況，而且也能為第一時間開展預測、以及流行病的控制提供有利條件。

1 糞大腸菌群檢測原理及檢測流程

1.1 發酵法原理及其檢測流程

發酵法適用于地表水、地下水、生活污水和工業廢水中糞大腸的測定。首先，針對發酵法檢測原理來講，經上文的分析可以明確，糞大腸菌群能都對乳糖起到分解作用的同時，產酸產氣，在多管發酵階段，乳糖蛋白胨培養基顏色會發生變化，并逐漸出現氣泡。其次，針對發酵法檢測流程來講，糞大腸菌群主要是借助乳糖蛋白胨多管進行發酵，在實驗培養階段，應從以下5點入手：①開展無菌實驗，科學合理的對其進行消毒和滅菌處理，避免實驗環境存有細菌。陽性及陰性對照實驗，確保陽性菌株呈陽性反應，陰性菌株呈陰性反應。②籌備水樣樣本，組建實驗組，以水樣污染程度為基礎，科學合理的明確接種量。通常情況下，可采用10mL、1mL、0.1mL。③準備三倍乳糖蛋白胨培養液或者單倍乳糖蛋白胨培養液，如果接種體積為10mL 的情況下，則可應用三倍乳糖蛋白胨培養液，而針對單倍乳糖蛋白胨培養液來講，更加適宜應用在接種體積≤1mL的情況下。④針對初發酵實驗來講，充分混勻被檢測水樣，并將其裝入培養液試管中，值得注意的是，要確保儲存試管和5 份培養液全部完成滅菌與消毒處理。并且將其放置在（37.0±0.5）℃的條件下培養（24±2）h。如果在培養的過程中發現產酸產氣的現象，則證明陽性反應。⑤復發酵實驗，對初發酵實驗呈陽性反應的試管輕微搖晃，在恒溫為（44.5±0.5）℃條件下培養（24±2）h。值得注意的是，在復發酵階段，培養基中可能會出現其他種類菌落。若想確保目標菌落的純度，要將其他菌落放置在溫度為（45.5±0.5）℃條件下的EC 肉湯培養基中單獨培養（24±2）h，在培養的過程中，要觀察其是否存在陽性產氣現象，如果存在，則表明滋生了糞大腸菌群。在發酵階段，通過最大可能數MPN 值與指數關系開展科學、精準的精算工作[2]。

式中：C——樣品中糞大腸菌群數，MPN/L；MPN——每100mL 樣品中糞大腸菌群，MPN/100mL；f——實際水樣最大接種量，mL；100——10×10mL，其中10 將MPN 值的單位MPN/100mL 轉換為MPN/L，10mL 為MPN 表中最大接種量，mL。

現階段，在我國糞大腸菌群的眾多檢測方式中，乳糖蛋白胨多管發酵法的應用較為常見，且在全世界范圍內的應用都較為普遍。對此，世界各地研究人員在乳糖蛋白胨多管發酵法方面達成一致，此類檢測方式成為國際標準檢測方式。乳糖蛋白胨多管發酵法的優勢為成本低、技術要求不高、不需要投入大量的人力、結果精準性較高等；劣勢為實驗操作過程煩瑣、檢測時間長，在獲得實驗結果之后，需要專人驗證實驗結果是否精準[3]。

在采用乳糖蛋白胨多管發酵法的過程中，對于實驗團隊人員數量也有著一定的要求，因此，基層機構難以確保乳糖蛋白胨多管發酵法的應用效果。隨著我國科技水平日新月異的發展，也帶動了乳糖蛋白胨多管發酵法的進一步發展，并且逐漸發展為五管法、十二管法、以及十五管法。

1.2 濾膜法原理及其檢測流程

濾膜法適用于地表水、地下水、生活飲用水和工業廢水中糞大腸菌群的測定，但當樣品渾濁度較高時，應選用其他方法。首先，濾膜法原理如下。實驗人員要做好實驗環境與儀器的滅菌、消毒等工作，將微孔濾膜放入過濾器內，倒入水樣，利用抽濾法對水樣進行過濾。在抽濾后，細菌被截留在濾膜上。將濾膜與培養基表面充分結合在一起，并科學合理的開展接種作業，將其放置在恒溫為（44.5±0.5）℃環境下實施培養，在整個培養的過程中，實驗人員應對其進行全面的觀察。如果培養基滋生糞大腸菌群的情況下，要求實驗人員其判斷是否滿足糞大腸菌群特點，做好菌落計數，測定樣品中糞大腸菌群濃度。

其次，濾膜法檢測流程如下。①對檢測水樣進行過濾處理，對工具進行滅菌消毒之后，借助工具夾起滅菌濾膜邊緣，觀察細膩的一面，并將其放在下面，將細膩面的濾膜放入過濾器內緊貼濾床，實施滅菌處理、添加水樣。添加水樣時根據樣品的種類判斷接種量，最小的過濾體積為10mL，如接種量小于10mL 應逐級稀釋。利用吸管提取待檢測水樣，值得注意的是，對于吸管同樣也要進行滅菌消毒后方可使用，開啟過濾器閥門實施負壓50kPa 的抽濾。②培養細菌，在對水樣進行過濾之后，對實驗儀器中的氣體進行抽出，5s 之后關閉過濾器閥門。將過濾器下置，帶菌落膜放置在MFC 培養基表面開展接種作業。在接種的過程中，要防止濾膜吸附菌種的一面朝下，將濾膜緊密貼合在培養基表面，如若不然，則可能會對菌種的正常生長帶來不利影響。在培養之后，做好培養皿的密封處理，并將其放入溫度為（44.5±0.5）℃培養箱中培養（24±2）h。③對實驗數據進行全面統計，計算菌落數量。糞大腸菌群顏色是藍色或者藍綠色，與其他菌落顏色對比來講，糞大腸菌群顏色好區分，再加上在培養環境溫度的作用下，其他菌落可能會與培養基試劑發生反應[4]。在培養中止之后，通過區分顏色，便可以判斷糞大腸菌群菌落，對其數量進行統計之后，以體積與濃度關系為基礎，獲得每升水樣中大腸菌群菌落的實際數量。計算公式：糞大腸菌群菌落數=。

最后，每次實驗都要進行對照實驗，分為空白對照和陽性陰性對照。空白對照即每次實驗都要用無菌水進行空白測定。陽性及陰性對照即陽性菌株呈陽性反應，陰性菌株呈陰性反應。

1.3 紙片快速檢測法原理及其檢測流程

紙片法適用于地表水、廢水中糞大腸菌群的快速測定。首先，紙片快速檢測法原理如下。針對實驗階段的濾紙吸收選擇性培養基來講，要確保濾紙和培養基之間貼合的緊密性，做好培養溫度與培養時間的把控，培養時間為24h。細菌在繁殖的過程中，難免會形成酸，導致溴甲酚紫指示劑顏色發生變化，與此同時，脫氫酶會促使底物還原為三苯甲臢，顏色成紅色，簡而言之，如果黃色背景下產生紅色斑點的情況下，則可明確樣品中是否滋生糞大腸菌群、以及滋生之后的糞大腸菌群濃度。其次，紙片快速檢測流程如下。具體來講，紙片快速檢測法和發酵法的流程大同小異。清潔水樣取10mL 水樣量紙片5 張，每張接種水樣10mL；然后，1mL水樣量紙片10 張，其中5 張接種水樣各1mL，另5 張各接種1：10 的稀釋水樣1mL。受污染的水樣接種3 個不同稀釋度的1mL 稀釋水樣各5 張。接種好的紙片將其放置在溫度為（44.5±0.5）℃的恒溫培養箱中培養18～24h，觀察有無菌落形成。當然每次實驗都要進行空白測定，培養后的紙片上不得有任何顏色反應，并使用標準菌株進行陽性、陰性對照實驗。菌落陽性反應參考：①紙片上出現紅斑或紅暈且周圍變黃。②紙片全片變黃，無紅斑或紅暈。菌落陰性反應參考：①紙片部分變黃，無紅斑或紅暈。②紙片的紫色背景上出現紅斑或紅暈，而周圍不變黃。③紙片無變化[5]。記錄菌落數量和紙片陽性情況，查MPN 值表得到MPN 值，按式（2）換算并報告1L 水樣中糞大菌群數：

式中：C——水樣總大腸菌群或糞大腸菌群濃度，MPN/L；M——查MPN 表得到的MPN 值，MPN/100mL；Q——實際水樣最大接種量，mL；100——10×10mL，其中10將MPN 值 的 單 位MPN/100mL 轉 換 為MPN/L，10mL 為MPN 表中最大接種量，mL。

1.4 酶底物法原理及檢測流程

酶底物適用于地表水、地下水、生活污水和工業廢水中糞大腸菌群的測定。首先，酶底物法原理如下。眾所周知，大腸菌群菌落能形成β-半乳糖苷酶，并對乳糖起到分解的作用，從而導致培養基有菌區域顏色出現變化。統計陽性反應出現數量，計算樣品中糞大腸菌群的濃度值。其次，酶底物法檢測流程如下。①根據樣品污染程度確定接種量，避免樣品培養后出現全部陽性或全部陰性。對于未知樣品，可選用多個接種量進行檢測。②將被檢測水樣容量控制在100mL，對量瓶進行消毒、滅菌處理之后，取出100mL 測試水樣或稀釋樣品，在水樣中添加MMO-MUG 粉末，并將粉末與水樣充分融合在一起。③將準備好的水樣溶液全部倒入97 孔定量盤。④如果在定量盤產生氣泡的情況下，用手撫平97孔定量盤背面，然后用程控定量封口機封口。⑤將其放置在溫度為（44.5±0.5）℃環境下培養并觀察（24±2）h。在此階段，如果檢測水樣顏色發生了變化的情況下，則表明被檢測水體滋生了糞大腸菌群，分別記錄97 孔定量盤中大孔和小孔陽性孔數。從97 孔定量盤法MPN中查得每100mL 中糞大腸菌群的MPN 值后，再根據不同稀釋度，按式（3）換算成糞大腸菌群數：

式中：C——樣品中糞大腸菌群數，MPN/L；MPN——每100mL 樣品中糞大腸菌群，MPN/100mL；f——實際水樣最大接種量，mL；1000——將C 單位由MPN/mL 轉換成MPN/L。

同樣每次實驗都要進行空白對照和陰性陽性對照。空白對照就是用無菌水按步驟進行測定，培養后的97 孔定量盤不得有任何顏色反應，否則該次實驗判定無效。陰性陽性對照就是用標準菌株制成菌懸液，按步驟進行操作，陽性菌株呈現陽性反應，陰性菌株呈現陰性反應。

2 檢測方式的檢測結果對比

多管發酵法、濾膜法、紙片快速檢測法以及酶底物法檢測結果如表1 所示。通過對表1 的分析可以明確，糞大腸菌群不同的檢測方式也存在一定的不同。針對發酵法和濾膜法來講，發酵法流程復雜、限制因素多、可行度低，再加上發酵法所耗實驗周期久，因此，發酵法應用不常見，濾膜法更為方便，但濾膜法有其局限性，其對渾濁度較高的樣品，無法檢測。紙片快速法與發酵法相對比而言，紙片快速法顧名思義，其操作流程簡單，不需要確認實驗，再加上精準度高，經濟實惠等優勢，其在對結果要求時間短的糞大腸菌群檢測中更為常見。針對酶底物法來講，其同樣操作簡單，一次實驗即可完成檢測，但在技術方面有著一定的難度，同時所需成本較高。

表1 糞大腸菌群不同檢測方式的檢測對比

3 結語

綜上所述，在糞大腸菌群檢測中，發酵法、濾膜法的應用較為普遍，值得注意的是，糞大腸菌群不同的檢測方式，都有其獨特的優勢與劣勢，因此，在糞大腸菌群檢測未來發展的過程中，要求業內人士加大不同檢測方式的研究力度，盡可能減少檢測成本的同時，避免投入大量的檢測時間，與此同時，也要注重檢測效率和檢測結果精準性的提升。