Sestrin2在缺血再灌注損傷中作用的研究進展

羅杰，廖師師，潘銳，陳榕，孟慶濤

武漢大學人民醫院麻醉科，武漢430060

缺血再灌注（IR）損傷常見于圍手術期，如嚴重感染、創傷、休克、腸梗阻、腸系膜動脈栓塞、腹主動脈瘤手術、體外循環手術、肝腎移植等，其發病率和病死率較高［1］。IR亦可造成腸道局部損傷，改變腸黏膜屏障功能，導致腸內細菌的內毒素和自由基遷移至腸外器官，從而引發多器官功能障礙甚至衰竭［2-3］。目前，IR發病機制尚未完全闡明，其病理機制主要包括內質網應激、線粒體自噬、自身免疫反應、細胞死亡、細胞凋亡等［4］。近來研究發現，Sestrin2是一種新型的應激誘導蛋白，已被證明具有兩個重要功能：C末端結構域抑制雷帕霉素復合物1（mTORC1），N末端結構域抑制氧化應激，這兩種功能對于預防和治療心血管疾病至關重要，包括IR損傷和心肌細胞肥大［5］。Sestrin2表達在炎癥反應期間明顯增加，以預防氧化應激并限制進行性器官損傷。Sestrin2基因的敲除，會導致一系列氧化應激損傷、更嚴重的炎癥反應和疾病惡化［6］。越來越多的證據表明，Sestrin2在疾病發病中起重要作用［7-8］。Sestrin2是一種保守的抗氧化劑、代謝調節因子，可被多種損傷所誘導，包括氧化應激、內質網應激、自噬、DNA損傷、缺氧等。在哺乳動物中，Sestrin2廣泛存在于多種組織細胞中，如神經細胞、神經膠質細胞、平滑肌細胞等。Sestrin2增強表達主要通過多種轉錄因子激活介導，包括p53、活化轉錄因子4 （ATF4）、激活蛋白1 （AP-1）和CCAAT/增強子結合蛋白（C/EBP）。Sestrin2 在N端結構域的一個小區域，是一種活性烷基氫過氧化物還原酶，此功能與一個由反應性Cys125和質子解離系統組成的螺旋-旋轉-螺旋基序有關［9］。Sestrin2和GATOR2間的相互作用依賴于DD基序，該基序由環中兩個相鄰的Asp406和Asp407殘基組成［9］?，F就Sestrin2在IR損傷中作用的研究進展綜述如下。

1 Sestrin2參與調控內質網應激反應

內質網是細胞內最重要的細胞器之一，參與一系列細胞的生理功能，錯誤折疊蛋白在內質網的積累引發內質網應激（ERS）反應，稱為未折疊蛋白反應（UPR）［10］。內質網應激誘導細胞凋亡主要通過蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）介導的C/EBP同源蛋白（CHOP）途徑、JNK途徑，活化轉錄因子6（ATF6）這3種跨ER膜蛋白開啟信號轉導途徑所介導。研究表明，PERK是ERS的主要整合者，并且PERK活性的特定調節可影響ERS誘導的細胞凋亡［4］。已有研究表明，腸IR損傷會在小腸細胞中誘導內質網應激反應，表現為內質網應激因子蛋白（葡萄糖調節蛋白78，GRP78）、PERK及與ERS相關的凋亡分子CHOP表達上調及其下游BcL-2表達下調，Bax表達上調［11］。研究發現，Sestrin2是由ERS激活的轉錄因子CCAAT-增強子結合蛋白β誘導的。一旦誘導，Sestrin2通過抑制雷帕霉素復合物1（mTORC1）的哺乳動物靶點而停止蛋白質合成，從而減弱ERS［12］。另外，在小鼠膿毒血癥模型中，研究發現Sestrin2能通過抑制內質網（ER）應激（ERS）相關核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）介導的ASC pyroposome形成和Caspase-1（CASP-1）活化，減少脾DCs的gasdermin D依賴性焦燒。此外，Sestrin2缺陷通過加劇PERK-ATF4-CHOP信號通路誘導NLRP3/ASC/CASP-1依賴性焦燒和促炎細胞因子的產生，導致膿毒癥小鼠病死率增加，抑制ERS可逆轉這一趨勢［13］。在白細胞介素-1β誘導髓核細胞（NP細胞）衰老和凋亡，從而導致椎間盤退行性變（IVDD）的模型中，研究發現，Eif2ak3/Eif2ak4-eIF2α-Atf4信號通路激活了Sestrin2，Atf4是Sestrin2的上游分子，Atf4基因的沉默可降低Sestrin2的mRNA水平和Sestrin2蛋白表達，Sestrin2的沉默降低了煙酰胺核苷對NP細胞的保護作用［14］。目前沒有Sestrin2在腸IR損傷的相關研究。Sestrin2在細胞內質網中存在，其表達變化與細胞內質網應激反應密切相關。內質網應激通過激活Sestrin2及其下游信號通路，影響細胞骨架和細胞運動，從而導致一系列生理病理改變。因此，研究Sestrin2及其下游信號通路在ERS發生過程中的作用有重要意義。隨著對Sestrin2功能認識的加深，將會為其在各種疾病中的作用提供新的見解，進而開發出具有治療作用的藥物。

2 Sestrin2促進線粒體自噬

線粒體通過氧化磷酸化在細胞供能中起核心作用。線粒體的其他功能包括脂質合成、信號轉導和鈣穩態維持。然而，線粒體也是活性氧（ROS）的主要來源，并通過釋放促凋亡因子細胞色素C來觸發細胞凋亡。線粒體自噬，即通過選擇性形式降解，是一種從酵母到人類保守的基本機制，參與了線粒體的質量和數量控制。線粒體自噬通過特定的線粒體外膜受體與線粒體表面蛋白質結合的泛素分子促進，導致線粒體周圍自噬小體的形成。線粒體自噬介導的消除在早期胚胎發育、細胞分化、炎癥和凋亡等過程中發揮重要作用。功能失調的線粒體，能產生ROS和誘導細胞死亡，將被自噬識別和清除。自噬通常是由各種壓力因素導致，如營養不足、缺氧、細胞內ROS、氧化應激和化學藥物等［14］。有研究發現，在人骨肉瘤細胞模型小鼠中，Sestrin2通過PERK-eIF2α-CHOP途徑抑制mTOR來激活自噬，并通過Bcl-2抑制骨肉瘤細胞凋亡，Sestrin2低表達可有效降低化療后人骨肉瘤細胞的自噬，增加p-mTOR表達，降低Bcl-2表達促進骨肉瘤細胞凋亡，減緩腫瘤進展［15］。另外，有研究發現Sestrin2作為一個新的p53靶基因，參與誘導自噬。在不同的自噬誘導劑處理下，Sestrin2在p53充足的細胞中表達增加，而在p53缺乏的細胞中則無增加，而敲除Sestrin2可減少由營養耗盡、雷帕霉素、鋰或毒胡蘿卜素引起的自噬。Sestrin2缺失不能影響p53缺陷細胞的自噬，也不能調節重新引入p53缺陷細胞的細胞質p53突變體對自噬的抑制。在p53充足的細胞系中，Sestrin2可作為自噬的積極調節因子［16］。近來，在魚藤酮誘導的帕金森病模型中，Sestrin2 mRNA和蛋白水平以p53依賴的方式顯著上調，沉默Sestrin2抑制自噬，同時增加自噬底物的積累，表現為輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）的下調、p62積累的加劇和AMPK磷酸化的抑制。相反，過表達Sestrin2可增強自噬活性，這可通過增強AMPK和p62的磷酸化或α-synuclein的降解來證明，從而保護細胞免受魚藤酮細胞毒性損傷。這些結果表明Sestrin2促進線粒體自噬，其機制可能與AMPK磷酸化密切相關［17］。有研究發現，Unc-51-like protein kinase 1 （ULK1）和p62是Sestrin2新的結合伙伴，且Sestrin2與ULK1的C端結構域存在物理聯系，從而激活其功能。此外，Sestrin2可與ULK1-Atg13-FIP200復合物相互作用，促進p62磷酸化，從而消除功能失調的線粒體和泛素化蛋白，調節Keap1-Nrf2通路。因此，誘導自噬可增強Sestrin2表達，并與多種自噬相關蛋白相互作用調節自噬活性［18］。此外，有研究發現，在白細胞介素-1β誘導NP細胞衰老和凋亡，從而導致IVDD的模型中，Sestrin2可作為椎間盤退行性病變中線粒體未展開蛋白反應（UPRmt）和線粒體自噬之間的調節因子。UPRmt通過eIF2α-Atf4-Sestrin2信號通路誘導線粒體自噬，減少細胞凋亡，改善NP細胞代謝，從而減輕椎間盤退變。UPRmt和線粒體自噬調節機制的紊亂可能是IVDD的危險因素。UPRmt激動劑煙酰胺核苷具有成為IVDD治療藥物的潛力［14］。Sestrin2與線粒體自噬關系密切，其在慢性炎癥引起的衰老和細胞凋亡中發揮重要作用，但我們對Sestrin2在IR損傷所致線粒體自噬的機制知之甚少，隨著對Sestrin2功能的深入研究，有望為IR損傷相關的疾病提供新的治療策略。

3 Sestrin2激活多種信號通路

在缺血缺氧相關疾病中，缺血缺氧導致氧化還原穩態失衡，ROS過度積累，導致細胞功能障礙。Sestrin2被證實與多種缺氧相關疾病有關，如大腦疾病、心肌疾病、呼吸系統疾病等［19］。有研究發現，Sestrin2受p53、缺氧誘導因子-1α和核因子紅細胞2相關因子2（Nrf2）等因素調控，其可通過促進自噬、抑制氧化應激和內質網應激發揮細胞保護作用［20］。在這一保護過程中，激活了多種途徑，如AMPK/mTOR途徑［21］、Nrf2/Keap1途徑［22］、MAPK8/JNK1途徑、ERK1/2途徑。其中，AMPK/mTOR和Nrf2/Keap1是Sestrin2在缺氧條件下參與的關鍵途徑。HAO等［23］報道，在夾閉肝動脈、門靜脈、部分膽管90 min，再灌注6 h的小鼠肝IR損傷模型中，IR組肝臟出現中重度水腫和廣泛的肝細胞壞死，血清轉氨酶水平和損傷評分均升高，Sestrin2蛋白表達上調。使用齊墩果酸（OA）預處理可降低IR組血清ALT、AST水平。HE染色表明，OA處理后IR組肝組織病理損傷得到改善，對應Suzuki′s（肝損傷評分）降低。與此同時，OA預處理的肝臟IR，上調了Sestrin2、PI3K、Akt和血紅素加氧酶-1（HO-1）表達，而給藥HO-1抑制劑鋅原卟啉（ZnPP）可降低OA對HO-1和Sestrin2表達的影響及OA對IRI的保護作用。該研究證明了Sestrin2作為一種抗氧化蛋白，對肝IR損傷的保護作用，與PI3K/Akt/HO-1信號通路有關，但未對PI3K/Akt和HO-1之間的關系進一步研究；此外，在肝IR損傷中OA誘導Sestrin2表達的機制未完全得到證實。MIGDALIA等［24］報道，在阻斷雙腎動靜脈15 min，再灌注24 h的急性腎損傷老鼠模型中，急性腎缺血再灌注損傷（AKI）上調了Sestrin2蛋白表達，使得腎組織結構和功能惡化，壞死小管百分比和血漿肌酐水平均增加，導致遠膈臟器的心肌細胞收縮和舒張功能障礙、心肌細胞損傷和纖維化及心肌細胞線粒體功能障礙，而二甲雙胍顯著改善了AKI誘導的心功能障礙，特別是對老齡小鼠心臟的收縮期和舒張期功能、纖維化和細胞損傷及線粒體功能的改善。而心肌細胞特異性敲除Sestrin2（cSesn2-/-）的小鼠則不存在此種改變。該研究局限于cSesn2-/-小鼠，Sestrin2基因仍存在于其他類型的細胞中，如內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和免疫細胞等。因此，對全Sestrin2基因敲除的小鼠心肌細胞進行免疫印跡可能會產生不同的結果，有待今后進一步驗證。QUAN等［25］報道，在冠狀動脈左前降支閉塞的心肌缺血再灌注小鼠模型中，心臟Sestrin2蛋白水平隨年齡增長而逐漸降低。與年輕心臟相比，老年心臟的缺血AMPK激活減弱，IR期間，老年心臟AMPK下游葡萄糖攝取和葡萄糖氧化率降低，老齡心肌梗死體積增大。利用Sestrin2 Ab免疫沉淀發現，心臟Sestrin2在缺血期間與AMPK和上游肝臟激酶B1形成復合物。與之相同的是，Sestrin2-ko小鼠心臟IR損傷后，心臟損傷指標明顯增大，AMPK活化減弱，而通過冠狀動脈輸送方法將腺相關病毒Sestrin2注入老年心臟，顯著挽救了Sestrin2蛋白水平和老年心臟的缺血耐受性。證實Sestrin2是一種與年齡相關的應激誘導蛋白，通過影響AMPK激活和底物代謝，在缺血損傷的適應性反應中發揮重要作用。對Sestrin2-AMPK信號轉導的進一步了解，將會是開發抗衰老相關IR損傷新治療策略的重要成果。

4 Sestrin2抑制氧化應激

ROS是通過氧化代謝、線粒體的生物學功能和免疫功能在體內不斷產生的。生理上的ROS對細胞內外的信號轉導至關重要。然而，在氧化應激下，過載的ROS可結合并破壞多數細胞生物分子（脂質、酶、糖、蛋白質、核酸和其他小分子）。氧化應激被認為是某些細胞環境中氧化還原特性的失衡，并在許多疾病發展中發揮關鍵作用，包括糖尿病、肥胖和心肌損傷［26］。抵抗氧化應激損傷是Sestrin2的重要功能之一。在氧化應激反應中，Sestrin2表達在mRNA和蛋白水平上受到多種轉錄因子的調控，包括核因子-κB、AP-1、C/EBPb、叉頭盒O3和p53［27］。Sestrin2被認為通過兩種主要的生物功能來維持氧化代謝的平衡。首先，作為一種抗氧化酶，Sestrin2能直接減少ROS的積累。然后，Sestrin2本身的催化抗氧化活性有限。其次，最近研究表明，Sestrin2抑制ROS的產生，保護細胞抵抗氧化應激，主要原因可能是其調節了幾個與氧化應激相關的信號通路：KEAP1/NRF2抗氧化信號通路及AMPK和mTORC1通路。NRF2是一種轉錄因子，可與抗氧化反應元件（ARE）結合，促進多個抗氧化分子的表達，以保護細胞免受氧化損傷。在生理條件下，NRF2在細胞質中組成性表達。在正常情況下，KEAP1與NRF2結合，阻止NRF2易位到細胞核，促進其泛素化和蛋白酶體降解，并在細胞質中維持低水平的游離NRF2。而在氧化應激下，NRF2從KEAP1中分離并易位到細胞核。NRF2與ARE結合可激活靶基因PRX、SRX、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、血紅素加氧酶1和谷胱甘肽過氧化物酶1的轉錄［28］。而在細胞研究中我們發現，Sestrin2與unc51樣激酶1（ULK1）和p62結合形成功能復合物，Sestrin2促進p62的磷酸化，進而促進KEAP1降解和NRF2激活［26］。近來有研究發現，在砷暴露誘導大鼠和原代肝細胞發生氧化應激模型中，Sestrin2/AMPK/ULK1通路的激活，導致溶酶體損傷，最終導致肝細胞壞死，其特征為LC3Ⅱ脂化、p62積累及RIPK1和RIPK3的激活。同樣，砷暴露也會損害原代肝細胞的溶酶體功能和自噬，NAC處理后溶酶體功能受損，Leu-peptin處理后溶酶體功能受損加重。而p62 siRNA后原代肝細胞壞死相關指標RIPK1和RIPK3的轉錄和蛋白表達均下降［29］。YANG等［30］報道，在小鼠大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）和小鼠原代皮層神經元細胞缺氧葡萄糖剝奪/再灌注（OGD/R）的腦缺血再灌注損傷模型中，損傷誘導了Sestrin2蛋白和POU域2類轉錄因子2（POU2F2）的表達上調。慢病毒介導的POU2F2敲除小鼠，進一步損傷了MCAO/R誘導的小鼠腦缺血再灌注損傷（CIRI），表現為神經功能缺損增加、腦梗死體積增加和神經元損失。在體內POU2F2的缺乏可通過下調Sestrin2蛋白表達，降低SOD、GSH、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的活性及ROS、脂質ROS、4-羥基壬烯醛和MDA的積累來惡化氧化應激和鐵死亡。在體外，敲除POU2F2的初級皮層神經元細胞也表現出更嚴重的神經元損傷、氧化應激和鐵死亡，與此同時降低了Sestrin2表達，加速了氧化應激和鐵死亡，進一步加重CIRI。而在小鼠原代皮層神經元細胞中，予以OGD/R處理，過表達Sestrin2可減輕氧化應激和下調POU2F2引起的鐵死亡。因此CIRI誘導了POU2F2和Sestrin2的代償性增加。下調POU2F2可能是通過降低Sestrin2表達，加速氧化應激和鐵死亡來加重CIRI。在未來，研究出上調Sestrin2的藥物可能為CIRI的治療機制提供新思路。

綜上所述，Sestrin2作為一種新型的抗氧化蛋白，在IR損傷病理生理過程中發揮重要作用，主要通過AMPK/mTOR途徑、Nrf2/Keap1途徑、MAPK8/JNK1途徑、AMPK/PGC-1α途徑、ERK1/2等，參與內質網應激、線粒體自噬、缺氧、氧化應激、鐵死亡、凋亡、焦亡等，從而發揮保護作用。IR損傷時，上調或激活 Sestrin2可一定程度減輕或改善組織器官的損傷，而上調Sestrin2的藥物及其作用療效需進一步研究與探索。