四妙湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠維生素D 系統(tǒng)及中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的影響研究

羅書曼，朱星，陳帥，李文，董右青，何昌祿，周艷，陳云志*

1.550025 貴州省貴陽市，貴州中醫(yī)藥大學(xué)

2.554300 貴州省銅仁市德江縣民族中醫(yī)院推拿科

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，主要病理特征為持續(xù)性滑膜炎和滑膜增生。目前全球RA 患病率約為1%［1］。RA 致死率不高，但有較高致殘率，對患者身體功能及生活質(zhì)量影響較大，有“不死癌癥”之稱。RA 患者發(fā)生心血管疾病等并發(fā)癥的概率遠(yuǎn)高于普通人，增加了患者因心血管疾病死亡的風(fēng)險，而糖皮質(zhì)激素作為RA 常用治療藥物，在臨床使用時增加了RA 合并心血管疾病患者的死亡率［2］。因此尋找低毒高效的RA 治療藥物是目前公共衛(wèi)生系統(tǒng)的共同挑戰(zhàn)。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，維生素D（VD）缺乏與自身免疫性疾病有關(guān)，其中血清25-羥基維生素D3［25（OH）D3］水平與RA 發(fā)病率和疾病活動之間存在負(fù)相關(guān)［3］。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，VD 可緩解RA 小鼠模型的關(guān)節(jié)炎癥狀，降低關(guān)節(jié)炎評分［4］。臨床研究表明，使用VD 補(bǔ)充劑可降低RA 發(fā)展風(fēng)險［5］。VD、維生素D 受體（VDR）及相關(guān)代謝酶共同組成維生素D 系統(tǒng)，維生素D 系統(tǒng)通過多種途徑參與免疫調(diào)節(jié)，其中通過抑制樹突狀細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）等細(xì)胞因子產(chǎn)生減少，抑制RA 的發(fā)生、發(fā)展［6］。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）是中性粒細(xì)胞受到刺激形成的以DNA 為骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［7］，其形成過程被稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)凋零（NETosis）。NETs 的過度表達(dá)在RA 病理過程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)抗瓜氨酸化抗體（ACPA）的產(chǎn)生，加重RA 進(jìn)程［8］。研究表明，VD 可通過降低NETs 標(biāo)志物髓過氧化物酶（MPO）活性，抑制NETs 形成［9］；活性形式的VD，即1，25-二羥基維生素D［1，25（OH）2D3］可降低NETosis 活性，抑制NETs 形成［10］。

中醫(yī)將RA 歸屬“痹證”范疇［11］?！氨浴闭撸伴]”也，血?dú)饽郎煌ㄒ玻?2］。氣血運(yùn)行不暢在痹證的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用，調(diào)暢氣機(jī)、活血通絡(luò)開痹是治療重點(diǎn)。四妙湯見于清·蔣示吉《醫(yī)宗說約》，是由兩個藥對組成的藥少力專的方劑，黃芪和當(dāng)歸組成當(dāng)歸補(bǔ)血湯，補(bǔ)氣生血，金銀花與甘草組為銀花甘草湯，清熱解毒，方中四藥合伍，共奏益氣合血、托里解毒功效［13］。研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對骨質(zhì)疏松大鼠模型維生素D 系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用［14］，當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對RA 滑膜炎癥有抑制作用［15］。基于中醫(yī)理論及前期研究成果，故推測，四妙湯通過調(diào)節(jié)維生素D 系統(tǒng)影響NETs 的形成有效改善RA。因此，本研究通過膠原誘導(dǎo)法建立滑膜型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，深入探索四妙湯治療RA 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)時間：2021 年11 月—2023 年1 月。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物：SPF 級6～7 周齡SD 雌性大鼠70 只，體質(zhì)量200～220 g，購自貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，許可證號：SCXK（黔）2021-0003，所有大鼠在貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所飼養(yǎng)，室溫22～25 ℃，相對濕度50%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所有程序通過貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所動物倫理審查（編號：20210100）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑：黃芪（批號：20210503）、當(dāng)歸（批號：20210609）、金銀花（批號：20210763）、甘草（批號：20210921）均購自北京同仁堂貴陽藥店，上述所有藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)方藥教研室蔣志濱副教授鑒定為合格中藥飲片。甲氨蝶呤片（MTX）（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：036210906），維生素D 滴劑（青島雙鯨藥業(yè)股份有限公司，批號：2104191），牛Ⅱ型膠原蛋白（上海源葉生物科技有限公司，批號：L22S11C125306），弗氏不完全佐劑（美國SIGMA 公司，批號：SLCH4885），冰乙酸（四川西隴科學(xué)有限公司，批號：2104131），大鼠IL-6、NETs、25（OH）D3ELISA 試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司，批號：ZC-36404、ZC-54723、ZC-35943），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）抗體（美國Affinity 公司，批號：AF7021、AF0010），1-α 羥化酶（CYP27B1）抗體（美國Rioss 公司，批號：Bs-14146R），MPO 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：22225-1-AP），VDR 抗體、24-羥化酶（CYP24A1）抗體（美國ABclonal 公司，批號：A2194、A1805）。

1.1.4 主要儀器：Multiskan MK3 型酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司），DYY-6C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），L500-A 型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），光學(xué)顯微鏡（德國Leica 公司），Universal Hood Ⅱ型核酸蛋白凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 四妙湯的制備：四妙湯水煎劑由黃芪、金銀花、當(dāng)歸、甘草按照10∶8∶2∶1 比例配伍組成，將4 味藥材用純凈水浸泡60 min 后，武火煮沸，轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，取濾液，重復(fù)操作，合并兩次濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮生藥濃度至0.63 g/mL 備用。

1.2.2 大鼠分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組（Control 組）、模型組（Model 組）、甲氨蝶呤組（MTX組）、維生素D組（VD組）、四妙湯低劑量組（SMT-L組）、四妙湯中劑量組（SMT-M 組）、四妙湯高劑量組（SMT-H組），每組10 只。

1.2.3 CIA 大鼠模型造模：大鼠參考文獻(xiàn)［16］造模，用蒸餾水配制0.05 mol/L 乙酸溶液，將牛Ⅱ型膠原蛋白溶于乙酸溶液中制成濃度為2 g/L 溶液，4 ℃環(huán)境下?lián)u床震蕩過夜至完全溶解，隔天冰上操作與弗氏不完全佐劑1 ∶1 比例混合制成膠原乳液。分別在大鼠背部、尾根部、雙側(cè)后足墊四點(diǎn)皮下各注射膠原乳液0.1 mL 進(jìn)行初次免疫，Control 組以相同方式注射等量0.9%氯化鈉溶液，初次免疫7 d 后，在大鼠背部及尾根部兩點(diǎn)皮下各注射0.1 mL 乳液加強(qiáng)免疫。以體質(zhì)量下降，大鼠關(guān)節(jié)、腳踝及足部出現(xiàn)泛紅伴隨腫脹作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)抽取2 只大鼠，采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠滑膜組織的病理學(xué)改變，若出現(xiàn)滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生等系列變化，提示CIA 模型建立成功。

1.2.4 藥物干預(yù)：于加強(qiáng)免疫7 d 后開始灌胃治療，根據(jù)成人用量按照人與大鼠體表面積折算等效劑量［17］，SMT-L、SMT-M、SMT-H 組分別給予四妙湯水煎液3.15 g·kg-1、6.30 g·kg-1、12.60 g·kg-1灌胃，VD 組給予VD 滴劑25 μg·kg-1，Control 組和Model 組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，MTX 組給予MTX 1.5 mg·kg-1灌胃，2 次/周，其余各組均為1 次/d，藥物干預(yù)28 d。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 大鼠一般狀況及踝部腫脹程度：觀察藥物干預(yù)前后，大鼠體質(zhì)量、攝食情況、四肢活動情況及皮毛色澤等一般狀況。每組選取10 只大鼠，分別于藥物干預(yù)第0、7、14、21、28 天用電子秤測量并記錄大鼠體質(zhì)量，用游標(biāo)卡尺測量大鼠踝部直徑，以評估踝部腫脹程度，當(dāng)前測量直徑減去初始測量直徑視為腫脹程度。

1.3.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分：分別于藥物干預(yù)第0、7、14、21、28 天，按照AI 評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分并記錄。0 分：關(guān)節(jié)無紅腫脹癥狀；1 分：踝關(guān)節(jié)輕微腫脹；2 分：踝關(guān)節(jié)輕度紅腫伴足趾有紅斑；3 分：踝關(guān)節(jié)累及足趾中度紅腫；4 分：踝關(guān)節(jié)及全足重度紅腫，每只大鼠的四肢累計(jì)得分為AI 評分。

1.3.3 關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)檢測：藥物干預(yù)結(jié)束后，將大鼠踝關(guān)節(jié)取下置于4%多聚甲醛固定72 h，脫鈣、流水沖洗24 h、標(biāo)本脫水、包埋、切片。采用HE 染色進(jìn)行切片，顯微鏡觀測并采集圖像分析大鼠關(guān)節(jié)組織病變情況。

1.3.4 免疫組化法檢測滑膜組織MPO、TNF-α 表達(dá)情況：將制備好的滑膜組織切片進(jìn)行脫蠟水化、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗、抗原修復(fù)、血清封閉孵育，配置合適濃度的一抗（MPO 1∶40，TNF-α 1∶50）4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗后滴加稀釋后的相應(yīng)二抗，37 ℃烘箱孵育30 min，PBS 沖洗后加入顯色液，脫水封片。將切片在顯微攝像系統(tǒng)下觀察并采集圖像，每張切片采集3 張，使用HALO 數(shù)字病理圖像分析工具分析每張圖像的MPO、TNF-α 陽性面積占比。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測大鼠血清中IL-6、25（OH）D3、NETs 水平：藥物干預(yù)結(jié)束后，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，室溫靜置30 min，4 ℃離心10 min（3 000 r/min，離心半徑14 cm），分離收集血清，置于-80℃冰箱備用，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清IL-6、25（OH）D3水平，采用基于MPO-DNA 復(fù)合物的捕獲酶聯(lián)免疫吸附法測定NETs 水平，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，顯色后在酶標(biāo)儀450 nm波長條件下依序測量各孔內(nèi)OD 值，并根據(jù)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品濃度。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測關(guān)節(jié)滑膜組織CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、彈性蛋白酶（NE）表達(dá)水平：分離出大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織放入2 mL 研磨管中，按樣本比例向管中加入RIPA 裂解液和鋼珠，低溫研磨儀研磨2 次，后設(shè)置離心機(jī)4 ℃以12 000 r/min離心5 min，分離出上清液置冰箱-20 ℃?zhèn)溆谩Ｒ勒誃CA 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)OD 值，計(jì)算樣本蛋白濃度。配置電泳膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）室溫下?lián)u床震蕩封閉2 h，TBST洗膜3 次，放入孵育盒，加入稀釋過的一抗4 ℃孵育過夜，一抗稀釋比例：CYP24A1（1∶1 000）、CYP27B1（1∶1 000）、MPO（1∶2 000）、VDR（1∶1 000）、NE（1∶1 000）。TBST 洗膜3 次，加入HRP 標(biāo)記二抗（1∶600稀釋），37 ℃搖床孵育2 h，TBST 充分洗膜。最后配置ECL 顯影液，均勻滴加到聚偏二氟乙烯膜上，暗室曝光成像，掃描膠片，用BandScan 凝膠圖像分析軟件分析膠片灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況及腫脹度變化

正常組大鼠四肢活動正常，精神狀態(tài)良好，攝食正常，皮毛有光澤；模型組大鼠自初次免疫7 d 后逐漸出現(xiàn)四肢活動異常，精神狀態(tài)不佳，喜蜷臥角落，皮毛晦暗。干預(yù)第0 天7 組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第7、14、21、28 天7 組大鼠體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中第7 天VD 組、SMT-L 組、SMT-H 組高于Model 組，第14 天Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-H 組高于Model 組，第21、28 天Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組高于Model 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 7 組大鼠體質(zhì)量比較結(jié)果（g）Table 1 Comparison of weight change result of rats in the seven groups

干預(yù)第0、7、14、21、28 天7 組大鼠腫脹程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中第0 天Model組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H組高于Control 組，第7 天Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組低于Model 組，第14天Model 組高于Control 組，SMT-M 組高于Model 組，第21 天Model 組高于Control 組、MTX 組，低于VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組，第28 天Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組低于Model 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 7 組大鼠腫脹程度比較結(jié)果（mm）Table 2 Comparison of the swelling degree of rats in the seven groups

2.2 7 組大鼠AI 評分比較

藥物干預(yù)第0、7、14、21、28 天，Control 組大鼠AI 評分均為0 分。干預(yù)第0、7 天各組大鼠AI 評分均高于Control 組（P＜0.05）；干預(yù)第14、21、28 天各組大鼠AI 評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中第14 天SMT-H 組低于Model 組，第21 天MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-H 組低于Model 組，第28 天MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組低于Model 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 7 組大鼠AI 評分比較結(jié)果（分）Table 3 Comparison of AI scores of rats in the seven groups

2.3 7 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)檢測結(jié)果

HE 染色組織細(xì)胞核呈藍(lán)色，軟骨呈深藍(lán)色，細(xì)胞漿呈粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈鮮紅色，膠原纖維呈淡粉色。Control 組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)完整，骨層清晰，襯里層滑膜細(xì)胞排列疏松，未見病理改變；Model 組大鼠滑膜組織襯里下層大量炎性細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞異常增生、關(guān)節(jié)面被破壞出現(xiàn)不同程度的纖維組織增生；與Model 組比較，各給藥組大鼠滑膜組織的病理狀態(tài)均有改善，其中MTX組、SMT-H組改善較為明顯，炎性細(xì)胞浸潤減少，關(guān)節(jié)面相對完整，少量纖維增生，見圖1。

圖1 7 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)檢測結(jié)果（HE 染色，×50）Figure 1 Results of joint synovial histopathology in 7 groups of rats

2.4 7 組大鼠滑膜組織MPO、TNF-α 表達(dá)水平比較

二氨基聯(lián)苯胺法染色蛋白陽性表達(dá)為棕黃色，MPO陽性產(chǎn)物主要表達(dá)于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)，TNF-α 陽性產(chǎn)物主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)。免疫組化法結(jié)果顯示，7 組大鼠滑膜組織MPO、TNF-α表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中Model 組MPO、TNF-α 高于Control 組，MTX 組、VD組、SMT-H 組MPO、TNF-α 低于Model 組，SMT-M組TNF-α 低于Model 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2～3、表4。

圖2 7 組大鼠滑膜組織MPO 表達(dá)情況（免疫組化法，×40）Figure 2 MPO expression in synovial tissue of 7 groups of rats

圖3 7 組大鼠滑膜組織TNF-α 表達(dá)情況（免疫組化法，×40）Figure 3 Expression of TNF-α in synovial tissue of 7 groups of rats

表4 7 組大鼠滑膜組織MPO、TNF-α 表達(dá)水平比較（%）Table 4 Comparison of MPO and TNF-α expression levels in synovial tissue of 7 groups of rats

2.5 7 組大鼠血清IL-6、25（OH）D3、NETs 水平比較

7 組大鼠血清IL-6、25（OH）D3、NETs 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中Model 組IL-6、NETs 高于Control 組，25（OH）D3低于Control 組；MTX 組、VD 組、SMT-H 組IL-6、NETs 低于Model 組，25（OH）D3高于Model 組；SMT-M 組NETs 低于Model 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 7 組大鼠血清IL-6、25（OH）D3、NETs 水平比較Table 5 Comparison of serum levels of IL-6，25（OH）D3 and NETs in 7 groups

2.6 7 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE 相對表達(dá)量比較

7 組大鼠CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中Model 組CYP24A1 高于Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-M 組、SMT-H 組，CYP27B1、VDR 低于Control組、MTX 組、VD 組、SMT-M 組、SMT-H 組，MPO 高于Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組，NE 高于Control 組、VD 組、SMT-M 組、SMT-H 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表6、圖4。

圖4 7 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果Figure 4 CYP24A1，CYP27B1，MPO，VDR，NE detected by Western Blot in synovial tissue of 7 groups of rats

表6 7 組大鼠滑膜組織CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE 相對表達(dá)量比較Table 6 Comparative expression of CYP24A1，CYP27B1，MPO，VDR and NE in synovial tissue of 7 groups of rats

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為RA 的病因主要為素體虛弱、正氣不足、臟腑虛衰［18］。《諸病源候論》指出“人體虛，腠理開”，導(dǎo)致風(fēng)、寒、濕三種外邪入侵，證候復(fù)雜，病勢反復(fù)纏綿；《素問·評熱病論篇》云：“邪之所湊，其氣必虛”［19］。四妙湯益氣和血，補(bǔ)虛生血，組方切合RA 基本病機(jī)，方中黃芪、當(dāng)歸、金銀花、甘草均屬于臨床治療RA 的高頻次用藥［20］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮A 是存在于甘草的活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎等多種藥理作用［21］，甘草中含有的柚皮素可通過影響大鼠血清中TNF-α 等炎性因子的含量，改善關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥細(xì)胞浸潤［22］。黃芪、金銀花、甘草中均含有的有效成分槲皮素和山奈酚能顯著改善RA，槲皮素是天然黃酮類化合物，通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制細(xì)胞增殖和遷移、減少炎性因子、促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞因子（FLS）的凋亡進(jìn)而抑制滑膜炎癥，減少RA 的骨損害［23］，山奈酚可顯著抑制絲裂原活化蛋白激酶通路的激活，降低RA中FLS 的遷移和侵襲，能有效減輕CIA 小鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度［24］。

本研究選擇與人類RA 病理特征高度相似的膠原誘導(dǎo)法構(gòu)建的CIA 大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Model 組大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、足趾關(guān)節(jié)腫脹、精神狀態(tài)異常等一般狀況，經(jīng)四妙湯干預(yù)后，大鼠體質(zhì)量明顯增加、足腫脹度降低、關(guān)節(jié)指數(shù)評分降低、滑膜組織病理狀態(tài)明顯改善。IL-6、TNF-α 作為引起RA 持續(xù)性滑膜炎的重要炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，其水平與RA 疾病程度存在正相關(guān)［25］。四妙湯干預(yù)后，可顯著降低CIA 大鼠血清IL-6水平，顯著降低滑膜組織中TNF-α 陽性表達(dá)。表明四妙湯能有效改善RA 病理癥狀，抑制RA 的炎癥反應(yīng)。

VD 缺乏與RA 發(fā)病率和嚴(yán)重程度有關(guān)［5］。人體獲取VD 的形式是VD2和VD3，而VD2對維生素D 結(jié)合蛋白（DBP）的親和力較低，生物利用度降低，因此VD在人體內(nèi)發(fā)揮免疫作用的形式主要是VD3。VD3依靠位于肝臟的CYP27A1 羥化為25（OH）D3，產(chǎn)生活性1，25-雙羥維生素D3［1，25（OH）2D3］，由CYP27B1介導(dǎo)，1，25（OH）2D3可作用于VDR 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。CYP27B1是維生素D活化的關(guān)鍵酶，CYP24A1是25（OH）D3、1，25（OH）2D3失活的羥化酶［26］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清25（OH）D3水平顯著降低，滑膜組織CYP27B1、VDR 蛋白表達(dá)顯著降低，CYP24A1 蛋白表達(dá)顯著升高。四妙湯干預(yù)后，顯著上調(diào)大鼠血清25（OH）D3水平及滑膜組織CYP27B1、VDR 蛋白表達(dá)，顯著下調(diào)CYP24A1 蛋白表達(dá)。表明四妙湯可能通過調(diào)控維生素D 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對RA 的治療作用。

免疫系統(tǒng)的作用始終貫穿RA 的發(fā)生、發(fā)展，中性粒細(xì)胞作為固有免疫吞噬細(xì)胞［27］，是人體非特異性免疫的重要組成部分，其經(jīng)過刺激釋放到細(xì)胞外的NETs在RA 中，是自身免疫抗原的重要來源，NETs 表達(dá)增加與RA 疾病狀態(tài)相關(guān)［28］，NETs 通過誘導(dǎo)ACPA 產(chǎn)生，刺激IL-6、TNF-α、白介素15（IL-15）等炎性因子的分泌，破壞機(jī)體免疫，參與RA 病理過程。NETs 的蛋白質(zhì)組分NE 可降解關(guān)節(jié)軟骨，加重RA 的炎癥反應(yīng)及骨破壞。NETs 及其產(chǎn)物MPO、NE 可作為RA 疾病活性標(biāo)志物［29］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清NETs水平顯著升高，滑膜組織MPO、NE 蛋白表達(dá)顯著升高，IHC 結(jié)果顯示MPO 陽性表達(dá)顯著升高，四妙湯高劑量及VD 干預(yù)后，則顯著降低大鼠血清NETs 水平、滑膜組織MPO、NE 蛋白表達(dá)、MPO 陽性表達(dá)。表明四妙湯與VD 改善RA 與抑制NETs 的形成及其成分MPO、NE的釋放相關(guān)。

綜上所述，四妙湯可能通過調(diào)控VD 系統(tǒng)抑制NETs 的形成有效改善CIA 大鼠RA 病理癥狀，為臨床治療RA 提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：羅書曼負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思與撰寫，數(shù)據(jù)處理及分析；朱星負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；羅書曼、陳帥、李文、董右青負(fù)責(zé)動物模型的制備、實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測；何昌祿、周艷負(fù)責(zé)文獻(xiàn)和資料收集、整理，文章修訂；陳云志提出實(shí)驗(yàn)的研究思路，負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施推進(jìn)與可行性分析，對文章最終版本進(jìn)行審核。

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