枳實(shí)和枳殼高效液相色譜指紋圖譜的建立*

李翅翔，黃玉蘭，袁常珍，鄒欣宴

（四川省瀘州市市場檢驗(yàn)檢測中心，四川 瀘州 646000）

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，于5～6月采收，干燥后直徑為0.5～2.5 cm，具有破氣消積、化痰散痞功效，可用于治療積滯內(nèi)停、痞滿脹痛、瀉痢后重、大便不通、痰滯氣阻、胸痹、結(jié)胸及臟器下垂［1］。枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，于7 月果皮尚綠時采收，干燥后直徑為3～5 cm，具有理氣寬中、行滯消脹功效，可用于治療胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、臟器下垂［1］。枳實(shí)專利低位性氣滯，枳殼專利高位性氣滯［2］。枳實(shí)、枳殼主要有黃酮類［3-4］、生物堿類［5］、揮發(fā)油［6］、香豆素類［7］、三萜類［8-9］等成分，具有抗菌消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗氧化、升壓、強(qiáng)心、促進(jìn)胃腸道功能、抗抑郁等作用［10-16］。目前的研究主要集中于枳實(shí)、枳殼指紋圖譜的分析［17-22］，但大多方法復(fù)雜，且指認(rèn)的共有峰較少，或樣本量較少，不能全面、真實(shí)地反映枳實(shí)、枳殼藥材的質(zhì)量。為此，本研究中建立了46 批次枳實(shí)和40 批次枳殼的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評價，為其質(zhì)量控制和評價提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司），配有二極管陣列檢測器；XS205DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg/0.1 mg）；KH7200 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為600 W，頻率為50 kHz）；UPHW - I - 90T 型微量分析超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 試藥

橙皮苷對照品（批號為110721 - 202220，含量為97.2%），新橙皮苷對照品（批號為111857-201804，含量為99.4%），川陳皮素對照品（批號為112055 -202102，含量為99.7%），辛弗林對照品（批號為110217-202110，含量為99.8%），枳殼對照藥材（批號為120981-202106），枳實(shí)（酸橙）對照藥材（批號為120936 -202107），均購于中國食品藥品檢定研究院；枸橘苷對照品（批號為M25HB179212，含量為99.2%），N-甲基酪胺對照品（批號為7-RTU-100-1，含量為95%），均購于上海源葉生物科技有限公司；新北美圣草苷對照品（批號為22051001，含量為98.33%），蕓香柚皮苷對照品（批號為PCS - 210309，含量為98.6%），柚皮苷對照品（批號為PCS-210913，含量為98.89%），柚皮素對照品（批號為PCS-210224，含量為99.21%），橙皮素對照品（批號為PCS-200811，含量為98.45%），桔紅素對照品（批號為PCS-210123，含量為98.78%），均購于北京中科質(zhì)檢生物有限公司；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司，批號為191614）；甲酸（批號為20100610），甲醇（批號為2022011802），十二烷基磺酸鈉（批號為20121023），均為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠；水為超純水；枳實(shí)、枳殼樣品信息見表1，產(chǎn)地均為四川瀘州王灣枳實(shí)、枳殼種植基地，經(jīng)四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院主任藥師黎躍成教授鑒定為正品。

表1 枳實(shí)和枳殼樣品信息Tab.1 Information of Aurantii Fructus Immaturus and Aurantii Fructus samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：枳實(shí)為乙腈（A）- 0.1%甲酸溶液和0.1%十二烷基磺酸鈉溶液（B），枳殼為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B'），梯度洗脫（0～26 min 時18%A，26～73 min 時18%A →62%A，73～74 min 時62%A →18%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：283 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；分析時間：74 min。在此色譜條件下，對照品溶液、對照藥材溶液和供試品溶液中，各成分均達(dá)到基線分離，理論板數(shù)按柚皮苷峰計應(yīng)不低于5 000。色譜圖見圖1。

1.新北美圣草苷 2.蕓香柚皮苷 3.柚皮苷 4.橙皮苷5.新橙皮苷 6.枸橘苷 7.辛弗林 8.柚皮素 9.N - 甲基酪胺 10.橙皮素 11.川陳皮素 12.桔紅素A - B.對照藥材溶液（枳實(shí)、枳殼） C - D.對照品溶液（枳實(shí)、枳殼） E - F.供試品溶液（編號分別為枳實(shí)S1、枳殼Q1）圖1 高效液相色譜圖1.Neoeriocitrin 2.Narirutin 3.Naringin 4.Hesperidin 5.Neohesperidin 6.Citrin 7.Synephrine 8.Naringenin 9.N - methyltyramine 10.Hesperetin 11.Nobiletin 12.TangeretinA - B.Reference medicinal materials solution（Fructus Aurantii Immaturus and Aurantii Fructus） C - D.Reference solution（Aurantii Fructus Immaturus and Aurantii Fructus） E - F.Test solution（numbered Aurantii Fructus Immaturus S1 and Aurantii Fructus Q1，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

供試品溶液：取46 批（編號為S1-S46）枳實(shí)藥材，粉碎，過4 號篩，取粉末0.1 g，精密稱定，置20 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲30 min，放冷，用甲醇定容，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得枳實(shí)供試品溶液。取40批（編號為Q1-Q40）枳殼藥材，粉碎，過4號篩，取粉末0.1 g，精密稱定，依上法制備枳殼供試品溶液。

對照藥材溶液：分別取枳實(shí)、枳殼對照藥材0.100 3 g和0.100 6 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，即得。

對照品溶液：取新北美圣草苷對照品9.87 mg、蕓香柚皮苷對照品9.03 mg、柚皮苷對照品10.36 mg、橙皮苷對照品15.29 mg、新橙皮苷對照品10.77 mg、枸橘苷對照品10.02 mg、辛弗林對照品10.17 mg、柚皮素對照品5.09 mg、N- 甲基酪胺對照品5.33 mg、橙皮素對照品4.90 mg、川陳皮素對照品10.63 mg、桔紅素對照品5.71 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇分別制成單標(biāo)貯備液；精密量取上述單標(biāo)貯備液各適量，置同一20 mL 容量瓶中，加甲醇制備枳實(shí)對照品溶液（質(zhì)量濃度分別為47.54，53.36，242.55，100.46，98.77，22.84，101.50，27.59，50.64，29.65，47.46，22.98 μg/mL）。取除辛弗林、柚皮素、N-甲基酪胺、橙皮素單標(biāo)貯備液外制備枳殼對照品溶液。以柚皮苷對照品溶液作為參照物溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：分別取枳實(shí)樣品（編號為S1）和枳殼樣品（編號為Q1）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖，以柚皮苷為參照峰，計算共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果，枳實(shí)樣品的12 個共有色譜峰的相對保留時間的RSD為0.007%～0.538%范圍之內(nèi)，相對峰面積的RSD為0.021%～1.521%；枳殼樣品的8 個共有色譜峰的相對保留時間的RSD為0.005%～0.047%，相對峰面積的RSD為0.601%～1.310%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取枳實(shí)樣品（編號為S1）和枳殼樣品（編號為Q1），依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h 時按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以柚皮苷為參照峰，計算共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果枳實(shí)樣品的12 個共有色譜峰的相對保留時間的RSD為0.074%～0.443%，相對峰面積的RSD為0.092%～1.997%；枳殼樣品的8 個共有色譜峰的相對保留時間的RSD為0.007%～0.260%，相對峰面積的RSD為0.665%～1.983%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別取枳實(shí)樣品（編號為S1）和枳殼樣品（編號為Q1），依法制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以柚皮苷為參照峰，計算共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果枳實(shí)樣品的12 個共有色譜峰的相對保留時間的RSD為0.068%～0.333%，相對峰面積的RSD為0.383%～1.771%；枳殼樣品的8 個共有色譜峰的相對保留時間的RSD為0.009%～0.133%，相對峰面積的RSD為0.233%～1.959%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜建立

枳實(shí)：分別取2.2項(xiàng)下枳實(shí)對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜采集，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）生成46批樣品的色譜指紋峰，設(shè)定時間窗寬度為0.1 min，采用中位數(shù)法結(jié)合多點(diǎn)校正進(jìn)行色譜峰匹配疊加（圖2）及對照指紋圖譜（圖3）。通過與對照品溶液保留時間和紫外吸收光譜圖對比，指認(rèn)其中12個共有峰，分別為新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、N-甲基酪胺、辛弗林、川陳皮素和桔紅素。

圖2 46批枳實(shí)藥材高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.2 HPLC overlay fingerprints of 46 batches of Aurantii Fructus Immaturus

圖3 枳實(shí)對照藥材高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.3 HPLC reference fingerprints of the reference medicinal materials of Aurantii Fructus Immaturus

枳殼：分別取2.2項(xiàng)下枳殼對照藥材溶液和枳殼供試品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜采集，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）生成40批樣品的色譜指紋峰，設(shè)定時間窗寬度為0.1 min，采用中位數(shù)法結(jié)合多點(diǎn)校正進(jìn)行色譜峰匹配疊加（圖4）及對照指紋圖譜（圖5）。通過與對照品溶液保留時間和紫外吸收光譜圖對比，共指認(rèn)8 個共有峰，分別為新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、川陳皮素、橘紅素。

圖4 40批枳殼藥材高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.4 HPLC overlay fingerprints of 40 batches of Aurantii Fructus

圖5 枳殼對照藥材高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.5 HPLC reference fingerprints of the reference medicinal materials of Aurantii Fructus solution

2.5 相似度評價

HPLC 指紋圖譜相似度評價結(jié)果顯示，46 批枳實(shí)藥材與枳實(shí)對照藥材指紋圖譜的相似度為0.900～0.996，非共有峰面積占比為2.13%～13.51%；40 批枳殼藥材與枳殼對照藥材指紋圖譜的相似度為0.963～0.995，非共有峰面積占比為4.74%～15.08%。枳實(shí)、枳殼與對照藥材的指紋圖譜相似度均大于0.900，相似度良好。詳見表2和表3。

表3 枳殼藥材相似度Tab.3 Similarity of Aurantii Fructus

3 討論

通過優(yōu)化流動相、檢測波長、柱溫、流速等色譜條件，建立了合適的分析方法。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求，可靠性高，能作為枳實(shí)、枳殼藥材的HPLC 指紋圖譜的分析方法。

采用該方法對46 批枳實(shí)藥材和40 批枳殼藥材進(jìn)樣分析，與對照藥材的相似度均大于0.900，表明枳實(shí)、枳殼與對照藥材所含化學(xué)物質(zhì)基本一致，不同采收時間得到的樣品質(zhì)量均一性較高，能對枳實(shí)、枳殼藥材的質(zhì)量進(jìn)行整體描述及評價。通過與對照品溶液的保留時間和紫外吸收光譜圖對比，枳實(shí)、枳殼藥材分別指認(rèn)了12 個和8 個共有峰，其中新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、川陳皮素、橘紅素為兩者共有成分，可作為枳實(shí)、枳殼藥材的質(zhì)量標(biāo)志物［23］，反映其共同點(diǎn)。相較于枳殼，柚皮素、橙皮素、N-甲基酪胺、辛弗林為枳實(shí)藥材的特有成分，可體現(xiàn)二者的差異。

綜上所述，本研究中建立的枳實(shí)、枳殼藥材HPLC指紋圖譜分析方法簡單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，樣品的收集具有一定代表性，能為其質(zhì)量控制和評價提供參考。