溫和灸對原發性痛經模型大鼠子宮微循環及血液流變學的影響

郭 莎 李雪梅 任奎羽 陳兆恒 楊 莎

(1 成都中醫藥大學針灸推拿學院,成都,610075; 2 南充精神衛生中心,南充,637000)

原發性痛經(Primary Dysmenorrhea,PD)也稱功能性痛經,是指生殖器官無器質性病變引起的痛經,臨床表現以月經前后與行經期間出現周期性痙攣性下腹部疼痛為主。PD在年輕女性中是最常見的婦科疾病[1],在一項針對中國女大學生的研究中,51.1%的女大學生均患有PD,其中PD中度以上的疼痛的患病率為33.1%[2]。并且PD會嚴重影響女性的身體健康及生命質量[3]。目前,PD尚無特效治療藥物,臨床上多以非甾體抗炎藥、避孕藥等藥物緩解疼痛[4],有一定療效,但不良反應也較多,包括長期使用可導致高血壓、腦卒中、心臟病等疾病的產生[5]。同時,有20%～25%的女性對上述藥物反應不佳[6]。

研究表明,溫和灸具有溫通經脈、活血止痛的作用,對PD有獨特療效,不良反應小,安全性高,能有效改善患者經期疼痛癥狀、中醫證候表現及生命質量[7-9]。PD的具體發病機制尚不明確,但有學者認為其發病機制可能與血液流變學及子宮微循環狀態有關[10-11]。同時課題組前期研究發現,溫和灸治療對PD患者的子宮微循環狀態改善明顯,表現在治療后患者子宮內血流增多、子宮動脈血流速度增快、血流阻力降低[12]。因此,在臨床有效的基礎上,溫和灸對子宮微循環及血液流變學的影響值得進一步研究。本研究對溫和灸治療PD可能的作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)雌性大鼠40只,鼠齡12周齡,體質量(255±25)g,性成熟未交配,成都達碩實驗動物有限公司提供(許可證號:SCXK 2015-030)。飼喂普通大鼠清潔級飼料,清潔飲水。本實驗已通過成都中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(倫理審批號:2020-01)。實驗過程對動物的處置遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.1.2 藥物 苯甲酸雌二醇注射液(寧波三生生物科技有限公司生產,批號:B191001)、縮宮素注射液(寧波三生生物科技有限公司生產,批號:S190204)。

1.1.3 試劑與儀器 10%水合氯醛(成都市科隆化學品有限公司,批號:20200811),艾條(臨湘市湖香艾生物科技有限公司)。體視顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司,型號:SMZ-168)、自動血流變測試儀(北京賽科希德科技發展有限公司,型號:SA-900)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應性喂養7 d,通過陰道涂片法確定其動情周期[13],根據細胞種類、形態及數量選出動情周期規律的SD雌性大鼠40只,按照隨機數字表法分為空白組、空白加艾灸組、模型組、艾灸組4組,每組10只。

痛經大鼠模型采用苯甲酸雌二醇聯合縮宮素法制備。除空白組、空白加艾灸組外,其余組大鼠均在每日固定時間給予腹部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,連續10 d,第1天及第10天每只每日注射0.5 mg,第2～9天每只0.2 mg/d,末次給藥1 h后,腹腔注射縮宮素2 U/只,記錄大鼠20 min內扭體反應。空白組、空白加艾灸組皮下注射同等劑量的生理鹽水,連續10 d。

1.2.2 干預方法 從第11天起,開始給予空白加艾灸組和艾灸組溫和灸治療,空白組和模型組同樣抓取、固定但不做治療,于每日固定時間開始,連續10 d。大鼠穴位定位,常規消毒,定位依據余曙光《實驗針灸學》[14]的動物穴位圖譜,關元:臍下約25 mm處;三陰交:后肢內踝尖上10 mm。溫和灸方法:空白加艾灸組和艾灸組各動物著自制鼠衣,并固定在自制鼠架上,暴露腹部及后肢,去除大鼠關元、三陰交處毛發約1 cm×1 cm,點燃艾條放置在離大鼠皮膚2～3 cm處,進行溫和灸。1次/d,20 min/次,連續10 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 扭體反應 最后一次注射苯甲酸雌二醇1 h后,除空白組、空白加艾灸組外每只動物腹腔注射催產素2 U,觀察20 min內扭體反應動物數及扭體次數,扭體反應表現為:大鼠腹部收縮內凹,軀干與后肢伸展,一側肢體內旋。

1.2.3.2 子宮微血管管徑 參考文獻[15],于治療結束1 d后,給予大鼠10%水合氯醛麻醉,于腹部正中線外約0.5 cm處行2～3 cm縱行切口,游離一側子宮及其韌帶,并將其置于體式顯微鏡下。于40X線鏡視野中觀察各組大鼠子宮微血管的顏色和管徑,并拍攝照片。最后,將鏡下子宮微血管圖片導入Image-Pro Plus軟件,測量微血管管徑并記錄。

1.2.3.3 血液流變學 大鼠麻醉狀態下,分離頸動脈,插管取血,使用SA-9000自動血液流變測試儀分析系統檢測血液流變學指標(全血黏度、紅細胞壓積、紅細胞變形指數、紅細胞剛性指數、紅細胞沉降率)。

1.2.3.4 子宮組織形態學觀察 動物處死后,迅速取出大鼠子宮,肉眼觀察并記錄子宮形態學改變。剔除脂肪和其他組織后,測量子宮分角橫徑并記錄。

2 結果

2.1 痛經大鼠扭體反應情況 與空白組與空白加艾灸組比較,模型組與艾灸組扭體潛伏期均顯著縮短,扭體次數均增加,差異有統計學意義(P<0.05);模型組與艾灸組扭體反應、扭體潛伏期比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠扭體反應比較

2.2 溫和灸對痛經大鼠子宮組織形態及子宮橫徑的影響 雌激素刺激后,模型組大鼠子宮體明顯增大,子宮內積液明顯增多,子宮橫徑較其余3組顯著增大,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,艾灸組子宮體增大不明顯,子宮橫徑明顯減少(P<0.01)。空白組與空白加艾灸組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。溫和灸對實驗性子宮增大有一定的抑制作用,而對正常狀態下的大鼠子宮形態影響不明顯。見圖1～2。

圖1 溫和灸對痛經大鼠子宮橫徑的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加艾灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲P<0.05

圖2 溫和灸對痛經大鼠子宮形態的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加艾灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲P<0.05

2.3 溫和灸對痛經大鼠子宮微血管管徑的影響 與空白組比較,空白加艾灸組子宮微血管管徑輕微擴張(P>0.05),模型組子宮微血管管徑顯著收縮(P<0.05),艾灸組子宮微血管管徑收縮明顯(P<0.05);與空白加艾灸組比較,模型組及艾灸組微血管管徑明顯收縮(P<0.05);與模型組比較,艾灸組子宮微循環管徑顯著擴張(P<0.05)。溫和灸可顯著擴張痛經大鼠子宮微血管管徑,改善子宮微循環障礙,但對健康大鼠子宮微血管管徑無明顯擴張作用。見圖3～4。

圖3 溫和灸對痛經大鼠子宮微血管管徑的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲▲P<0.05

圖4 大鼠子宮微血管管徑(×40)注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加灸組比較,△△P<0.01;與模型組比較,▲▲P<0.05

2.4 溫和灸對痛經大鼠全血黏度的影響 與空白組比較,模型組與艾灸組所有切變率下的全血黏度均降低,差異有統計學意義(P<0.05);與空白加灸組比較,模型組全血黏度切變度5、30及200均降低(均P<0.05);與模型組比較,艾灸組全血黏度有增高趨勢(P>0.05)。見圖5。

圖5 溫和灸對痛經大鼠全血黏度的影響注:與空白組比較,**P<0.01;與空白加灸組比較,△△P<0.01

2.5 溫和灸對痛經大鼠紅細胞變形指數、紅細胞剛性指數、紅細胞壓積及紅細胞沉降率方程K值的影響 與空白組比較,模型組紅細胞壓積、紅細胞剛性指數及紅細胞沉降率方程K值下降較明顯(P<0.05),艾灸組紅細胞沉降率方程K值及紅細胞壓積下降明顯(P<0.05)。與空白加艾灸組比較,模型組及艾灸組紅細胞沉降率方程K值及紅細胞壓積下降明顯(P<0.05)。與模型組比較,艾灸組方程K值、紅細胞壓積、紅細胞剛性指數及變形指數有升高的趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。其余指標差異無統計學意義(P>0.05)。苯甲酸雌二醇聯合縮宮素造模法可能導致大鼠紅細胞沉降率方程K值、紅細胞壓積、紅細胞變形及剛性指數降低。經溫和灸干預后,痛經模型大鼠紅細胞沉降率方程K值、紅細胞壓積、紅細胞變形及剛性指數均有上升的趨勢。見圖6。

圖6 溫和灸對痛經大鼠紅細胞剛形指數、紅細胞變性指數、紅細胞壓積,紅細胞沉降率方程K值的影響注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白加灸組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.6 大鼠子宮微血管管徑與子宮橫徑、全血黏度各切變度相關性 大鼠微血管管徑與子宮橫徑、全血黏度各切變度間均存在線性關系,其中微血管管徑與子宮橫徑負相關(-1

3 討論

大鼠的動情周期受下丘腦-垂體-性腺軸支配,為規律的非妊娠生殖活動[16],因此,在痛經模型制備前,篩選動情周期規律的雌性大鼠至關重要。篩選完成后采用苯甲酸雌二醇聯合縮宮素造類痛經模型,在雌激素的作用下,非妊娠大鼠子宮肌層縮宮素受體含量上升[17],大鼠腹腔注射縮宮素后,縮宮素與子宮肌層的縮宮素受體相結合,從而引起子宮平滑肌劇烈痙攣收縮,誘發大鼠出現扭體反應[18]。扭體反應是目前應用最廣的內臟痛模型之一,也是痛經模型成功與否的重要判定指標[19]。本研究中,經苯甲酸雌二醇聯合縮宮素造模法造模后大鼠出現扭體潛伏期縮短,扭體次數顯著性增加,均提示痛經大鼠模型制備成功。

子宮循環系統中最基礎的結構為子宮微血管與毛細血管間的血液循環,研究表明,子宮微血管管徑范圍為11～100 μm,而<10 μm的血管管徑則為毛細血管,子宮微血管異常可引起包括PD在內的一系列婦科疾病[20]。研究顯示,微血管通透性增加,血漿蛋白可隨液體滲出血管,導致組織液的生成超過回流,引起組織、器官水腫和功能障礙[21-22],外滲的水腫液可壓迫微血管,加劇管腔狹窄[23],進而加快血液運行,而血液運行的加快及血漿蛋白的減少均可降低血液黏度[24],最終影響微血管灌注,導致組織缺血缺氧。雌二醇作為血管通透性誘導因子,可以誘導血管內皮生長因子的表達,使子宮內膜微血管通透性增加,進而導致子宮水腫的發生[25]。本研究中,經苯甲酸雌二醇聯合縮宮素造模后大鼠出現子宮橫徑增大,子宮組織水腫增生,同時本研究發現子宮橫徑與子宮微血管管徑負相關,表現為子宮微血管管徑狹窄收縮。而子宮微血管管徑與全血黏度正相關,出現全血黏度各切變度下降,同時引起紅細胞沉降率方程K值、紅細胞變形指數、紅細胞剛性指數、紅細胞壓積均下降,影響紅細胞聚集及變形作用[26],導致血液黏度降低,最終造成子宮缺血缺氧,引發痛經。經溫和灸治療后,痛經大鼠子宮橫徑減少明顯,子宮水腫明顯減輕,微血管管徑明顯擴張,血液黏度則有恢復正常的趨勢。同時溫和灸作為應激刺激,未引起正常大鼠即空白加艾灸組各項指標的改變。

艾灸主要通過艾葉等易燃材料或藥物燃燒后的溫熱刺激及藥物作用進行防病治病。研究表明,艾灸可以明顯改善PD的疼痛程度及癥狀評分,且安全可靠,不良反應少,患者依從性高[9,27]。中醫學認為,PD屬“經行腹痛”范疇,病位在胞宮、沖任,主要病機為“不通則痛”或“不榮則痛”。關元為足三陰與任脈交會穴,有升陽補氣、調理沖任之功效。三陰交為足三陰之交會穴,具有疏肝理氣、養血調經之功效。關元、三陰交配合可使沖任氣機通暢,氣血調和,相關研究顯示,灸法治療PD腧穴運用頻次最高為關元、三陰交,兩穴配伍關聯亦最高[28]。因此,本研究最終選取關元、三陰交兩穴配伍使用。

本研究結果顯示,通過苯甲酸雌二醇聯合縮宮素造模法建立PD大鼠模型成功,與健康大鼠比較,PD大鼠存在子宮水腫,微血管管徑收縮,血液流變學指標下降,這可能是PD的發病機制。溫和灸干預后子宮水腫減輕,子宮微血管管徑擴張,血液流變學相關指標有上升的趨勢,子宮微循環障礙顯著改善。表明改善PD大鼠子宮水腫、血液流變性及微循環狀態是溫和灸治療PD可能的作用基礎,具體的機制有待于進一步研究。

利益沖突聲明:無。