利用CRISPR/Cas9 系統構建SIRT1 基因敲除的K562 細胞株

溫后烺，陳 婧，曾杰清，彭流泉，陳日玲，馬國達，張海濤，汪亞君*（.廣東醫科大學順德婦女兒童醫院，廣東佛山 58300；.廣東醫科大學生化教研室，廣東湛江 5403）

慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是骨髓造血干細胞克隆性增殖形成的惡性腫瘤，約占成人白血病的15%，是一種造血系統的惡性疾病，嚴重危及患者的生命[1]。在過去的幾十年中，科學家們致力于尋找治療白血病的方法，然而對這種疾病的分子復雜性、藥物的最佳排序、不良事件的管理以及成功停止治療的標準仍未達成一致意見[2]。這是因為白血病的發病機制仍未完全明了，有效的細胞模型對于研究白血病的分子機制和藥物效應十分重要。

沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是III 類組蛋白去乙?；竤irtuins 家族成員。SIRT1 可以調節大多數血液腫瘤的生存途徑。SIRT1 失調在白血病發生中的起著重要作用，特別是在CML中，可被BCR-ABL和KRAS癌基因激活[3-4]。由BCR-ABL 激活的SIRT1 影響CML 分子病理的多個方面，如CML祖細胞存活、獲得性突變、腫瘤發展和藥物抵抗等。從慢性CML到疾病晚期，隨著SIRT1表達的進一步增加，SIRT1 調節的易出錯的DNA修復可能是CML 進化到更高惡性狀態的基礎[3-5]。此外，SIRT1 促進CML 細胞獲得BCR-ABL 突變，以抵抗酪氨酸激酶抑制劑[6]。抑制SIRT1 可選擇性地降低CML 的白血病干細胞（Leukemia stem cells,LSC）的生存和增殖，并使它們對酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine kinase inhibitors，TKI）治療敏感[7]，提示抑制SIRT1 可能是清除CML 患者LSC 和增強TKI 療效的一種潛在策略。

近年來，CRISPR/Cas9 系統被廣泛應用于基因編輯領域，且被認為是一種非常有前途的技術[8]。利用CRISPR/Cas9 系統，科學家可針對特定的基因進行定點突變、敲除或修飾，從而進一步理解這些基因在生物體中的功能。K562 細胞是第一個人紅白血病細胞系，在丁酸鈉、羥基脲等誘導下，它可向紅系分化；在佛波酯作用下,可向巨核系分化；在六亞甲基雙乙酰胺誘導下，又可向單核巨噬細胞系分化，是研究包括CML在內的血液系統疾病很好的細胞模型。在K562 細胞中敲除SIRT1 基因，有助于更深入地研究SIRT1 在白血病中的作用及分子機制。在本研究中，我們將利用CRISPR/Cas9 系統構建SIRT1 基因敲除的K562 細胞株，旨在為白血病的分子機制研究提供更好的細胞模型。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

人紅白血病細胞K562（由本實驗室保存）。RPMI 1640 培養基、胎牛血清、100X 青-鏈霉素、Lipo3000轉染試劑，人SIRT1 第一抗體，RNA 提取試劑盒，Realtime PCR反應試劑盒，均從銳競采購平臺購買。

1.2 實驗方法

1.2.1 SIRT1 敲除載體的設計與獲取 根據CRISPR/Cas9 設計原則，登陸CRISPR/Cas9 設計網站https://zlab.bio/guide-design-resources，輸入人SIRT1 基因后，根據網站生成的序列，選擇一對互補的靶向SIRT1 基因第5 個外顯子（SIRT1 的酶活性中心）的sgRNA 并合成，sgRNA 的序列為：AGAGATGGCTGGAATTGT CC，在sgRNA序列的正向鏈5’端添加AACG-，反向鏈5’端添加-ACAG。合成的sgRNA退火后插入酶切后的質粒PB-CRISPR（Addgene 160047），構成重組質粒PBSIRT1-sgRNA質粒（SIRT1 基因敲除質粒）。該質粒可在哺乳動物細胞中同時表達Cas9、目的基因的sgRNA和puromycin抗性基因。

1.2.2 質粒轉染和有效性驗證 按照每孔5×105個細胞接種K562 細胞到12 孔板，24 h 后采用lipo3000脂質體轉染試劑分別轉染2 μg SIRT1 基因敲除質粒pLenti-SIRT1-sgRNA 或無靶向的對照質粒pLenti-Control-sgRNA，轉染24 h 后更換新鮮培養液繼續培養。細胞轉染48 h后，250 g離心收集細胞，按照DNA提取試劑盒說明書分別提取轉染組和野生組細胞的基因組DNA，并送上海生工測序，檢測SIRT1 第5 外顯子附近基因序列。

1.2.3 嘌呤霉素篩選 常規接種野生型K562 細胞于12 孔板，24 h 后依照0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1、2 mg/L的終質量濃度加入嘌呤霉素繼續培養，每天觀察細胞數量，選擇72 h能夠殺死所有細胞的最小質量濃度作為細胞篩選質量濃度。質粒轉染48 h后更換為含有嘌呤霉素的培養基篩選陽性細胞，篩選3 d 后收集部分細胞用于免疫印跡檢測目的基因表達，部分細胞繼續培養用于篩選穩定表達的單克隆細胞株。

1.2.4 免疫印跡 300 g離心收集細胞，PBS洗滌后，加入含有PMSF 和蛋白酶抑制劑的細胞裂解液冰上裂解30 min，10 000 g離心去除細胞碎片。以上獲得的細胞裂解液經BSA 定量，上樣至經聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉移到PVDF 纖維素膜上，經抗人SIRT1 第一抗體以及辣根過氧化物酶第二抗體孵育后，采用凝膠成像儀成像分析蛋白相對表達量，以β-Actin作為內參。

1.2.5 單克隆的篩選和擴增 收集篩選后存活的細胞，細胞計數后按照每10 個細胞/mL的標準稀釋，混合后接種到96 孔板，平均每孔1 個細胞。細胞接種在顯微鏡下觀察單細胞的孔并標記?？寺∩L2 周后，顯微鏡下選擇已充分擴增的克隆轉移到24 孔板繼續擴增。

1.2.6 單克隆基因組PCR 檢測 待細胞生長至足夠的數量后，采用天根基因組DNA提取試劑盒根據說明書基因組DNA，采用Blast設計的引物擴增包含SIRT1第5 外顯子的基因片段。引物序列如下：5’-TGCATA TGACAGCAACCGTC-3’；5’-TTCTCGATGGCAGTC AGCTT-3’；PCR條件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25 個循環；72 ℃ 1 min。

1.2.7 細胞增殖分析 取對數生長期的待測細胞，接種到96 孔板中，每孔含約1×104個細胞，每天取1 組細胞，每孔加入10 μL CCK8 試劑，置于培養箱中避光再孵育2 h，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值并繪制細胞增殖曲線，每組設3 個重復。

1.3 統計學處理

采用 SPSS 25.0 軟件和 Prism 9 軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 質粒載體構建

采用上述方法構建質粒PB-CRISPR-KOSIRT1，本文通過DNA測序驗證sgRNA編碼序列。如圖1 所示，質粒中的插入序列與我們設計的sgRNA編碼序列：5’-AGAGATGGCTGGAATTGTCC-3’一致。

圖1 sgRNA編碼序列測序結果

2.2 細胞轉染驗證

PB-CRISPR-KOSIRT1 質粒擴增后轉染K562 細胞。增殖旺盛期的K562 細胞接種于6 孔板，取4 μg的質粒用Lipo3000 轉染到細胞，轉染24 h后換液，48 h后收集細胞提取基因組DNA，對SIRT1 第5 外顯子附近的序列進行測序鑒定。結果顯示，與野生型細胞相比，轉染組在第5 外顯子起始位置，即sgRNA配對位置出現復合峰，提示該位置出現序列變異（圖2）。

圖2 野生型和PB-CRISPR-KOSIRT1 質粒轉染的K562 細胞基因組測序結果

圖3 K562 細胞嘌呤霉素篩選結果

2.3 細胞篩選

為篩選出穩定插入質粒的細胞，避免質粒的敲除效應在細胞傳代中丟失，本文擬篩選穩定轉染的單克隆細胞株。

2.3.1 藥物篩選質量濃度的確定 為確定最適合的篩選藥物質量濃度，本文在12 孔板常規接種K562 細胞，并于24 h后分別加入0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1、2 mg/L的嘌呤霉素進行篩選，選擇72 h能夠殺死所有細胞的最小藥物質量濃度為應用質量濃度。結果顯示，72 h殺死細胞的最小質量濃度為2 mg/L（圖3）。

2.3.2 篩選后免疫印跡鑒定 轉染的細胞經篩選和擴增2 周后，收集并裂解細胞，用免疫印跡法鑒定SIRT1蛋白的表達情況。結果顯示野生型和空載體轉染組（Con）SIRT1 均可正常表達，而目標敲除質粒轉染組（KO）SIRT1 表達幾乎檢測不到（圖4）。

圖4 免疫印跡檢測SIRT1 的表達

2.4 單克隆細胞的獲取

本文采用有限稀釋法在96 孔板接種單克隆細胞。K562 細胞作為一種半貼壁細胞，不易形成穩定的單克隆簇，為改善細胞的貼壁和克隆形成情況，本文用0.1%的明膠預處理培養板，經過7 d的生長后，96 孔板形成了多個細胞單克隆，SIRT1 敲除組克隆形態整體上較空載體組?。▓D5）。

圖5 細胞單克隆7 d后的形態

2.5 SIRT1 基因敲除細胞的特征檢測

為進一步明確獲得的SIRT1 基因敲除單克隆細胞的特征，本文分別提取以上單克隆細胞的基因組DNA，用PCR的方法擴增了包含第5 外顯子的SIRT1基因片段，凝膠電泳結果顯示所有克隆均可擴增出與野生型大小一致清晰的條帶，說明該區域基因組沒有發生大片段的缺失突變（圖6A）；細胞裂解物免疫印跡顯示，敲除的克隆KG3、KC5 和KB7 均幾乎觀察不到SIRT1 蛋白的表達（圖6B），CCK8 法對這幾個單克隆細胞的生長曲線分析顯示SIRT1 基因敲除導致細胞不同程度地增殖減緩（圖6C）。

圖6 單克隆細胞的特征檢測

3 討論

本文利用CRISPR/Cas9 系統成功構建了SIRT1基因敲除的白血病單克隆細胞株，并對敲除效果進行了測序分析和蛋白表達分析，驗證了該方法在實現基因敲除上的有效性。該細胞株遺傳背景清晰，敲除效果明確，為研究SIRT1 基因在血液疾病中的功能研究研究提供了有用的工具。

本文采用了CRISPR/Cas9 技術進行基因敲除。相比于傳統的基因敲除方法，CRISPR/Cas9 系統可以靶向識別和位點特異性DNA切割，具有更高的準確性和效率，是非常強大的基因編輯工具[9-11]。CRISPR/Cas9載體包含Cas9 蛋白表達序列和gRNA序列，人工設計的gRNA前部被稱為sgRNA，負責識別目標位點，下面的部分作為與Cas9 蛋白結合的支架。當CRISPR/Cas9載體被導入靶細胞后，會表達Cas9 和gRNA，進行靶向基因識別和DNA切割，實現基因敲除的目的[9,12]。在基因敲除后，本文通過測序分析和蛋白表達分析來驗證基因敲除的效果。這些分析結果證實了SIRT1 基因已被成功敲除，為后續研究提供了強有力的實驗基礎。

關于細胞生長速度緩慢的現象，筆者認為SIRT1敲除可能引起細胞的應激反應和代謝紊亂，從而導致細胞生長速度的減緩。首先，SIRT1 在細胞生長和分裂中發揮著重要作用，SIRT1 的缺失可能會影響細胞正常的生長和分裂[13]。此外，SIRT1 在細胞代謝中也發揮了重要作用，缺失SIRT1 可能會影響細胞代謝水平，從而影響細胞的生長和增殖[14]。另外，SIRT1 還參與了多種信號轉導通路的調控，如NF-κB、p53、AMPK等[15-16]，SIRT1 缺失可能會導致這些信號通路失去平衡，進而影響細胞的生長和增殖。此外，SIRT1 缺失可能會導致細胞凋亡增加，從而導致細胞生長緩慢。有研究發現，在白血病中，SIRT1 抑制了p53 介導的細胞凋亡，而缺失SIRT1 則可能導致p53 介導的細胞凋亡增加，從而影響細胞生長和增殖[4]。此外，SIRT1 還可以抑制ROS的產生和細胞氧化應激，缺失SIRT1 可能會導致ROS的產生增加，從而促進細胞凋亡[17]。

通過本研究的SIRT1 基因敲除模型，我們可以更深入地探究SIRT1 在白血病中的作用機制。例如，我們可以通過測定SIRT1 基因敲除細胞中的基因表達譜，分析SIRT1 對哪些基因表達起到調控作用，并且探究這些基因在白血病發生、發展中的作用。此外，我們還可以研究SIRT1 對白血病細胞增殖、存活、凋亡等生物學過程的影響，進一步探究SIRT1 在白血病中的作用機制。

盡管經過了盡量嚴謹的設計和實驗，本文仍存在一些局限性。例如，近期報道Cas9 可能會影響p53 的水平[18]，而SIRT1 是p53 的互相調節分子。因此，本細胞系的p53 水平變化可能不僅僅由SIRT1 基因敲除導致，進一步構建無外源基因的SIRT1 基因敲除細胞是我們未來的研究方向。