食用菌中6 種核苷酸的UHPLC 檢測(cè)方法的建立*

代秋瓊，孫達(dá)鋒，華 蓉，陳 勇，曹燕妮，鄧雅元，吳素蕊，游金坤**

（1.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221；3.云南云菌科技（集團(tuán)） 有限公司，云南 昆明 650221；4.南京工業(yè)大學(xué) 國(guó)家生化工程研究中心，江蘇 南京 210009）

食用菌是指能形成菌核組織或大型肉質(zhì)子實(shí)體的一類(lèi)大型真菌，俗稱蘑菇。常見(jiàn)的食用菌有香菇（Lentinula edodes）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、金針菇（Flammulina velutipes）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、松茸（Tricholoma matsutake）、牛肝菌（Boletus spp.）、羊肚菌（Morchella spp.）、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、灰樹(shù)花（Grifola frondosus）、雞油菌（Fructificatio cantharelli） 等。食用菌不僅味道鮮美，還富含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如維生素、脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、氨基酸等，且在其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生和積累多糖、三萜類(lèi)、天然有機(jī)鍺、核苷酸等多種活性成分[1-4]。食用菌濃郁的鮮香風(fēng)味和特有的菌菇味道促進(jìn)了食用菌作為食材、功能性食品和調(diào)味品的消費(fèi)。食用菌中的鮮味物質(zhì)可以用于開(kāi)發(fā)食用菌天然風(fēng)味增強(qiáng)劑和食用菌天然調(diào)味品[5]。食用菌風(fēng)味主要表現(xiàn)為嗅覺(jué)帶來(lái)的香味感受和味覺(jué)帶來(lái)的滋味感受，通過(guò)嗅覺(jué)感受的香味主要包括一些揮發(fā)性化合物和酸、醛、酮、酯類(lèi)化合物等；而通過(guò)味覺(jué)感受到的鮮味和甜味主要取決于食用菌中所含的非揮發(fā)性物質(zhì)，包括糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、核苷酸等[6-7]。食用菌風(fēng)味是產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，食用菌風(fēng)味形成的影響因素有很多，對(duì)風(fēng)味成分進(jìn)行分析研究，不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)食用菌產(chǎn)品的品質(zhì)控制，還可對(duì)產(chǎn)品分級(jí)、改良及新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有輔助作用。

食用菌中除含有氨基酸外，還有較多的核苷酸類(lèi)物質(zhì)，具有鮮味的有鳥(niǎo)嘌呤核苷酸（guanosine 5’-monophosphoric acid，GMP）、肌苷5’-肌苷酸（inosine 5’-monophosphate，IMP）、黃嘌呤核苷酸（xanthosine-5’-monophosphoric acid，XMP） 等5’-核苷酸。目前對(duì)食用菌中核苷酸測(cè)定的報(bào)道鮮少，對(duì)云南省野生菌的呈香呈味物質(zhì)的研究也較少[8]。為此，試驗(yàn)通過(guò)對(duì)食用菌中尿嘧啶核苷酸（uridylic acid，UMP）、胞嘧啶核苷酸（cytidine monophos phate，CMP）、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、肌苷5’-核苷酸、5’-磷酸腺苷（Adenosine 5’-monophosphate monohydrate，5’-AMP）、黃嘌呤核苷酸共6 種核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，建立食用菌6 種核苷酸的UHPLC 檢測(cè)方法并進(jìn)行方法學(xué)考察，為食用菌的鮮味評(píng)價(jià)和產(chǎn)品精深加工提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器：190～800 nm），賽默飛世爾科技（中國(guó)） 有限公司；5430R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、移液器，艾本德（上海） 國(guó)際貿(mào)易有限公司；EOAA-HM-01 多管漩渦混合儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；SB-25-12D 超聲波清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；Sevenmulti S40 酸度計(jì)、XSRI05D 十萬(wàn)分之一天平，梅特勒托利多科技（中國(guó)） 有限公司；UPR-II-10T超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.2 試劑

尿嘧啶核苷酸（純度≥98%）、肌苷5’-核苷酸（純度≥98%）、乙酸銨（HPLC 級(jí)），西格瑪奧德里奇（上海） 貿(mào)易有限公司；胞嘧啶核苷酸（純度≥92.78%）、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸（純度≥98%）、5’-磷酸腺苷（純度≥92.6%），艾吉析科技（上海） 有限公司；黃嘌呤核苷酸-5-磷酸二鈉鹽（純度≥98%），森嵐科技有限公司；甲醇（色譜純），默克化工技術(shù)（上海） 有限公司。

1.3 樣品

食用菌樣品包括香菇、松茸、青頭菌（Russula virescens）、白蔥（Boletus albidus）、雞油菌、奶漿菌（Lactarius volemus）、美味牛肝菌（Boletus edulis）、黃賴頭（Leccinum crocipodium）、雞址樅（Termitornyces albuminosus）、紅蔥（Boletus speciosus）、干巴菌（Thelephora ganbajun）、老人頭（Catathelasma ventricosum） 12 種。子實(shí)體陰干，粉碎過(guò)80 目篩保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗(yàn)方法

2.1 條件篩選試驗(yàn)

根據(jù)主要色譜峰的峰面積和分離度，確定最優(yōu)樣品前處理和色譜條件。

1） 前處理?xiàng)l件篩選。提取溶劑：水、20%甲醇、0.1%乙酸水。料液比：1 ∶10、1 ∶20。超聲提取時(shí)間：30、40、60 min。

2） 色譜條件篩選。色譜柱：Waters Atlantis T3色譜柱、Themo Scienfic AQUASIL C18 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm） 和YMC-Pack QDS-AQ 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相溶液：乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-10 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液-0.12%磷酸溶液、甲醇-10 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液、體積比為1 000∶40的磷酸鹽緩沖液（1.40 mmol·L-1四丁基硫酸氫銨，0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀） 和甲醇混合液、甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨溶液。流速設(shè)定：0.5、0.6、0.8、1.0 mL·min-1。柱溫：25、30、35 ℃。

2.2 UHPLC 測(cè)定食用菌中6 種核苷酸的方法

2.2.1 色譜條件

YMC-Pack QDS-AQ 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相A 為甲醇，流動(dòng)相B 為10 mmol·L-1乙酸銨（用乙酸調(diào)pH 至4.0），流速為0.8 mL·min-1，梯度洗脫方式見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫方式Tab.1 The gradient elution method of mobile phase

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取尿嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、肌苷5’-核苷酸、5’-磷酸腺苷、黃嘌呤核苷酸磷酸二鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg （精確到0.001 g），分別置于6 個(gè)10 mL 容量瓶中，加超純水溶解并定容，搖勻，即得對(duì)應(yīng)濃度的各核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

分別精密移取上述儲(chǔ)備液于同一容量瓶中，配制成濃度為100 μg·mL-1的尿嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、肌苷5’-核苷酸、5’-磷酸腺苷、黃嘌呤核苷酸磷酸二鈉鹽混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.2.3 樣品溶液的制備

精密稱取均勻的試樣1 g，置于50 mL 離心管中，精密加入20 mL 水，搖勻，稱定質(zhì)量。隨后超聲提取40 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。3 000 r·min-1離心10 min ，上清液用0.45 μm 水系微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

3 結(jié)果及方法學(xué)考察

3.1 條件篩選試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)色譜峰的峰面積和分離度，最終確定樣品前處理以水為溶劑，料液比為1 ∶20，超聲40 min 進(jìn)行提取。比較3 個(gè)色譜，Waters Atlantis T3 色譜柱和Themo Scienfic AQUASIL C18 色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm） 對(duì)核苷酸的分離效果不好，經(jīng)考察最終選擇YMC-Pack QDS-AQ 色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm） 進(jìn)行色譜分析。比較不同流動(dòng)相溶液發(fā)現(xiàn)，以磷酸鹽緩沖液（1.40 mmol·L-1四丁基硫酸氫銨，0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀）-甲醇（磷酸調(diào)pH 為3.1） 和甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨溶液（冰醋酸調(diào)pH 為4.0） 為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰的分離度最好，且基線平穩(wěn)，但四丁基硫酸氫銨對(duì)色譜柱的損傷比較大，且分析時(shí)間較長(zhǎng)，經(jīng)綜合考慮選擇甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨溶液（冰醋酸調(diào)pH 為4.0）作為流動(dòng)相。比較不同流速、不同柱溫下各待測(cè)成分的分離度，最終確定流速為0.8 mL·min-1、柱溫為30 ℃。依據(jù)篩選結(jié)果最終建立2.2 中UHPLC 測(cè)定食用菌中6 種核苷酸的方法。

以香菇為例，按篩選獲得的測(cè)定方法，對(duì)核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)品和香菇樣品溶液進(jìn)行UHPLC 分析測(cè)定，核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1，香菇樣品溶液色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of nucleotide mixed standards

圖2 香菇樣品中6 種核苷酸色譜圖Fig.2 Chromatogram of 6 nucleotides in Lentinula edodes sample

如圖1 和圖2 所示，以香菇為例按照篩選得到的樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行提取，按照篩選得到的色譜條件進(jìn)行UHPLC 分析，獲得的色譜圖中峰的分離度好。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系考察

取2.2.2 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為100.00、50.00、25.00、20.00、16.00、12.50、8.00、6.25、4.00 μg·mL-1的工作液，按2.2.1 色譜條件分別進(jìn)行HPLC 分析，測(cè)定峰面積，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6 種核苷酸線性回歸方程Tab.2 Linear regression equation of 6 nucleotides

由表2 可知，結(jié)果顯示建立的UHPLC 檢測(cè)方法下6 種核苷酸在4～100 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2＞0.999 7。

3.2.2 精密度考察

配制適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定混合對(duì)照品溶液中各核苷酸的峰面積。計(jì)算得到尿嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、肌苷5’-核苷酸、5’-磷酸腺苷、黃嘌呤核苷酸測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD （relative standard deviation，RSD） 分別為0.163%、0.137%、0.097%、0.394%、0.035%、0.195%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性考察

精密稱取樣品粉末約1 g，按照2.2.3 的方法制備樣品溶液，進(jìn)行UHPLC 分析，分別在0、3、6、9、12、24 h 測(cè)定峰面積。以香菇為例，計(jì)算得到尿嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、肌苷5’-核苷酸、5’-磷酸腺苷、黃嘌呤核苷酸檢測(cè)結(jié)果的RSD （n=6） 分別為4.80%、2.84%、11.85%、13.00%、11.09%、5.59%。試驗(yàn)結(jié)果可以看出，24 h之內(nèi)樣品溶液中各核苷酸類(lèi)化合物穩(wěn)定，說(shuō)明該方法穩(wěn)定可靠，可以進(jìn)行色譜分析。

3.2.4 重復(fù)性考察

平行稱取6 份樣品，按照2.2.3 樣品溶液的制備方法進(jìn)行處理，再按照已確定的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定樣品中6 種核苷酸的峰面積，計(jì)算RSD 值。以香菇為例，尿嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、肌苷5’-磷酸、5’-磷酸腺苷、黃嘌呤核苷酸檢測(cè)結(jié)果的RSD 值分別為2.53%、9.28%、5.62%、8.77%、12.51%、11.08%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

3.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱量樣品1 g，平行稱取9 份，分別加入適量的混合核苷酸對(duì)照品溶液，按照2.2.3 樣品制備方法進(jìn)行前處理并進(jìn)行UHPLC 分析。以香菇為例，檢測(cè)得到尿嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、肌苷5’-核苷酸、5’-磷酸腺苷、黃嘌呤核苷酸的平均回收率分別為91.38%、93.65%、117.47%、95.33%、93.14%、90.61%，RSD 分別為2.12%、3.06%、4.16%、7.72%、6.10%、3.41%。結(jié)果表明該方法能夠滿足分析要求。

3.3 樣品檢測(cè)結(jié)果

方法學(xué)考察證明該方法準(zhǔn)確可靠，使用建立的方法分別測(cè)定12 種食用菌樣品中6 種核苷酸，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 12 種食用菌中6 種核苷酸含量Tab.3 Contents of 6 nucleotides in 12 kinds of edible fungi

4 結(jié)論

開(kāi)發(fā)了用UHPLC 同時(shí)測(cè)定食用菌中尿嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、肌苷5’-核苷酸、黃嘌呤核苷酸、5’-磷酸腺苷6 種核苷酸的檢測(cè)方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠，可用于食用菌中核苷類(lèi)成分的含量測(cè)定。該研究可為食用菌的鮮味評(píng)價(jià)和產(chǎn)品深加工提供參考依據(jù)。