食（藥）用菌內參基因篩選研究進展*

張曉華，孫達鋒，，劉紹雄，，李建英，李雪松，岳萬松，高章會，華 蓉**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌產業發展研究院，云南 昆明 650221）

研究基因表達差異對于了解基因功能和調控機制具有重要作用[1]。隨著組學技術的快速發展和日益完善，可通過研究同種食（藥） 用菌不同菌株、同一菌株不同發育階段或不同培養條件下的基因表達差異，篩選與生物學性狀及表型差異相關的功能基因，最終幫助我們了解食（藥） 用菌生長發育過程中相關基因的調控機制，以便為食（藥） 用菌遺傳育種工作的開展提供指導。目前基因表達量測定的方法有Northern 印跡法、微陣列法、基因表達連續分析法（SAGE）、實時熒光定量PCR （RT-qPCR）等[2]。其中RT-qPCR 由于具有操作簡單、靈敏度高、特異性強、重復性好、分析結果準確等優勢，已普遍用于基因表達分析[1]。

RT-qPCR 的結果易受RNA 質量、逆轉錄效率、引物特異性、轉錄物標準化等多種技術因素的影響。為消除這些因素帶來的試驗誤差，通常需要引入合適的內參基因，以便對目的基因的表達量進行校正。QIAN 等[3]的研究結果顯示，在用RT-qPCR 分析目標基因表達差異時，如果選用了不合適的內參基因，可能會得到不可靠甚至錯誤的結論。因此，合適的內參基因對定量分析結果的準確性尤其重要。內參基因通常是維持細胞基本功能的組成型表達基因，理論上，其表達水平在所有樣品中應該是恒定的[4]；但事實上并沒有適用于所有物種的內參基因，同一物種在不同的發育階段、不同菌株之間以及同一菌株在不同試驗條件下，最適內參基因也不相同。例如關于草菇（Volvariella volvacea） 的研究表明，在寒冷和高溫脅迫下，MSF1 基因表達較穩定；在Na－Cl 和CuSO4脅迫下，UBQ 基因表達最為穩定；而在酸脅迫中MAPK 基因的穩定性最好[3]。關于靈芝（Ganoderma lucidum） 的試驗結果也顯示，在短時間的茉莉酸甲酯、水楊酸和過氧化氫處理下，Actin 和UCE2 基因的穩定性較好；但在長時間的茉莉酸甲酯、水楊酸和過氧化氫處理下，這2 個基因的穩定性卻最差[5]。因此，同一菌株使用相同的培養基，在不同的試驗條件下最適內參基因也各不相同。此外，在黑木耳（Auricularia heimuer） 中進行了最適內參基因的研究，結果顯示18S rRNA、β-TUB、EF1-α和28S rRNA 在不同菌株間表現出較好的穩定性，而APRTase、18S rRNA 和28S rRNA 適合作為研究不同發育階段基因表達差異的內參基因[6]。以上研究表明，在使用RT-qPCR 開展食（藥） 用菌基因表達分析前，根據不同的試驗條件和物種選擇合適的內參基因十分必要。

近年來，隨著食（藥） 用菌基因組和轉錄組數據在各大數據庫的相繼公布，越來越多的候選功能基因亟需進行基因表達差異分析，這使得RT-qPCR技術廣受歡迎，各食（藥） 用菌中能穩定表達的內參基因的篩選也受到了許多研究者的關注。食（藥）用菌研究中常見的內參基因詳見表1。

表1 食（藥） 用菌中常見的內參基因Tab.1 The internal reference gene in common edible and medicinal fungi

如表1 所示，在這些研究中所用的內參基因大部分是從植物或動物中借鑒，大量證據表明在動植物中穩定表達的18S rRNA、Actin、GAPDH 等傳統內參基因在食（藥） 用菌中并不穩定[10]。比如在草菇[3]、靈芝[7,16]、毛木耳[12]等食（藥） 用菌中18S rRNA 是最不穩定的內參基因，但在許多食（藥） 用菌的內參基因篩選中還是將這些基因作為研究對象。

隨著大部分食（藥） 用菌轉錄組測序工作的逐步完成，許多穩定性較好的新內參基因被篩選，詳見表2。

表2 基于轉錄組數據篩選的候選內參基因Tab.2 Screening candidate reference gene sets based on transcriptome data

如表2 所示，相比于從動植物研究中借鑒的傳統內參基因，從轉錄組數據中篩選得到的候選內參基因的穩定性更高，更適合用于RT-qPCR 數據的校正和標準化。

目前食（藥） 用菌內參基因篩選的試驗方案與動植物的研究類似，首先是根據基因表達分析的試驗設計收集樣品，對樣品進行RNA 提取和cDNA 的合成；其次是候選內參基因的選擇及引物設計，然后進行RT-qPCR 試驗；再使用geNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder 等軟件對試驗結果進行評價，最終篩選出最合適的內參基因。

1 候選內參基因集的選擇

植物內參基因的篩選已經有大量的報道，食（藥） 用菌中相關的工作也在逐步開展[20-21]。隨著靈芝[5]、平菇[17]、草菇[3]、蛹蟲草[11]等的研究，表明在食（藥） 用菌中通用的內參基因并不存在，都需要在基因表達分析前先進行內參基因的篩選。SONG 等[13]在竹黃菌內參基因篩選的研究中，選擇了11 個在其他物種中常用的內參基因作為候選基因集，結果表明UBI、VAC 和TFC 3 個內參基因的穩定性較好。ZHANG 等[14]根據竹黃菌的轉錄組數據，以SONG 等確定的3 個穩定性好的內參基因（UBI、VAC 和TFC） 和9 個新基因組成候選內參基因集，對12 個候選內參基因開展了篩選工作，結果顯示穩定性排名前7 的均是基于轉錄組數據篩選出的候選內參基因，而UBI、VAC 和TFC 的排名則相對靠后。竹黃菌內參基因的篩選結果說明，用于篩選的候選內參基因集不同，篩選到的最佳內參基因也不相同。這就提示我們，合適的候選內參基因集是內參基因篩選的重要前提，若候選內參基因集不合適，可能導致篩選到的內參基因并非最優，甚至需要額外使用更多的內參基因進行基因表達分析。以往在食（藥）用菌最適內參基因的篩選研究中，候選內參基因集通常是選擇在動物、植物中具有一定代表性的內參基因，遺憾的是這些內參基因在食（藥） 用菌中的穩定性并不一致。對目前食（藥） 用菌內參篩選工作中常見內參基因的研究次數和研究結果進行了梳理，統計結果詳見圖1、圖2。

圖1 研究次數較多的常見內參基因Fig.1 Common internal reference genes that have been studied more frequently

圖2 使用頻率較高的理想內參基因Fig.2 Ideal reference gene with higher frequency of use

如圖1、圖2 所示，ACT1、β-TUB、GAPDH、18S rRNA、UBQ、TUB-1a、EF1-α 在食（藥） 用菌內參基因篩選中作為候選內參基因次數最多，同時也是被選擇作為理想內參基因頻率最高的常見內參基因。

目前，在草菇、平菇、羊肚菌等研究中已經成功將轉錄組數據運用到候選內參基因集的選擇中[3，17-18]。在這些研究中，候選內參基因集通常由數個依據轉錄組數據得到的穩定性較高的新內參基因和幾個傳統的內參基因組成。在羊肚菌的研究中發現，雖然候選內參基因集中包含轉錄組數據篩選到的新內參基因，但傳統內參基因Actin 表現出較好的穩定性[18]。ELENA 等[22]在平菇內參基因篩選時，選擇了RAUL 等[17，23]在另外2 項研究中認為較為穩定的內參基因作為候選內參基因。這說明在選擇候選內參基因時，若研究的物種已經開展過相關研究，可以將前人篩選出的穩定性較好的內參基因加入候選基因集中進行篩選驗證。同時，若研究物種缺乏相關的轉錄組數據，也可以選擇目前在食（藥） 用菌中研究次數較多且穩定性相對較好的傳統內參基因作為候選基因。綜上所述，候選內參基因的選擇最好是基于轉錄組數據進行分析及挖掘，同時可以根據研究物種和特定的試驗條件引入部分傳統的內參基因。

2 常用分析軟件

目前常用的分析軟件有geNorm、NormFinder 和BestKeeper。

geNorm 是在實時熒光定量PCR 中，用于內參基因篩選和最佳內參基因數目分析的軟件。該軟件對候選內參基因的數目和試驗條件無任何限制，最終從候選內參基因集中挑選出至少2 個最優內參基因用于數據的校準，可使相對定量的結果更為準確[24]。RTqPCR 試驗中得到的原始Ct 值要轉換為相對定量數據才能輸入到geNorm 軟件中進行分析。首先找到每一個候選內參基因在所有樣品中的最小Ct 值，然后用其他樣品的Ct 值減去最低Ct 值，此時得到的值就是△Ct 值（該值≥0）。最后計算每個樣品的2-△Ct值，將該值輸入geNorm 軟件，通過計算每個候選內參基因在不同樣品中的平均變異值M （average pairwise variation），最終呈現出候選內參基因集穩定性排名的折線圖和最佳內參基因數目，從而篩選出穩定性較好的內參基因組合[24]。判定標準為M 值小于1.5 即可作為內參基因，且M 值越低代表內參基因的穩定性越好；反之，則表明其穩定性較差[15]。有報道認為當M 值≤0.2 時，代表該候選內參基因具有較高的穩定性[9]。

NormFinder 也是用于候選內參基因穩定性篩選的軟件，數據處理及判定標準和geNorm 相同。表達穩定值越小的內參基因穩定性越高，最終根據表達穩定值的大小單獨顯示出最穩定的內參基因。NormFinder 程序既可以比較候選內參基因的表達差異，同時也能計算樣品組間的變異，但該程序最終只呈現一個最佳的內參基因[24]。

BestKeeper 是一款基于Excel 分析內參基因和靶基因表達量的分析工具。與geNorm 和NormFinder所不同的是，BestKeeper 是直接使用不同樣本RTqPCR 試驗中得到的原始Ct 值進行分析，根據Ct 值得到標準差（SD） 和變異系數（CV）。SD 值和CV值越小，則該內參基因的穩定性越好；若SD＞1 則表明該內參基因不穩定，最好不用于基因表達量分析，據此對每個候選內參基因的表達穩定性進行評估[25]。

RefFinder 是一款集成了geNorm、NormFinde 和BestKeeper 3 個主要內參基因篩選軟件的綜合分析工具，根據每個軟件對內參基因的排名，給每個候選內參基因的穩定性賦予一個適當的權重，并計算出權重的幾何平均值，最終給出候選內參基因集的總排名[15]。以geNorm 軟件進行分析，發現在黑木耳不同菌株間28S rRNA 表達最穩定，但以BestKeeper 和NormFinder 軟件進行分析的結果卻顯示該基因表現一般，這種情況在香菇[8]、靈芝[7]等食（藥） 用菌的研究中均存在。而在草菇[3]和竹黃菌[13]中的研究表明，使用geNorm 和NormFinder 分析內參基因穩定性時往往能得出相同的結論，但BestKeeper 軟件的分析結果則與這2 個軟件有一定的出入，在植物內參基因篩選研究中也出現過類似的現象[26-27]。這可能是因為BestKeeper 依賴于候選參考基因的標準差來評估其穩定性，而geNorm 和NormFinder 則根據基因的累積標準差和成對穩定性來評估內參基因。由于每種軟件的算法不同，使用不同的軟件進行分析時內參基因的穩定性排名會有細微差異，因此有必要先使用多種分析軟件對RT-qPCR 結果進行分析，再通過RefFinder 軟件對分析結果進行綜合排名，最終篩選出最佳的內參基因[3，14]。

3 最佳內參基因的確定

在確定內參基因時，首先需要使用geNorm 軟件，根據平均成對變異值（V） 的比值確定最佳內參基因的數量，當Vn/Vn+1值＜0.15 時，表明最佳內參基因的數量是n 個，當Vn/Vn+1值＞0.15 時，則表明最佳內參基因的數量是n+1 個[24]。在草菇的研究中指出Vn/Vn+1的比值不應該是嚴格的0.15，經geNorm軟件分析顯示最佳內參基因的數量是2，研究者分別選擇了SPRYp+UBQ （穩定性排名前二）、SPRYp+UBQ+TUBα （穩定性排名前三） 和SPRYp+UBQ+TUBα+28S rRNA （穩定性排名前三的基因加最不穩定的28S rRNA 基因） 作為內參基因，對G6PDH 基因的表達量進行了分析，結果表明只要按照geNorm軟件分析出的最佳內參基因數量選擇內參基因，即使額外的內參基因的穩定性較差也不會影響目標基因表達量的分析結果[3]。在其他研究中也提出使用2個最優的內參基因組合對RT-qPCR 的結果進行校正和標準化是可靠的，但使用geNorm 軟件可能會給出1 個較為客觀的最佳內參基因數量，使基因表達分析的結果更加精確。此外，許多食（藥） 用菌的研究結果表明，僅使用1 個內參基因對靶基因的表達量進行分析是不夠的，需要根據候選內參基因的排名情況，結合軟件推薦的最佳內參基因數量，選擇2 個及以上的內參基因對RT-qPCR 結果進行校正，以保證分析結果的可靠性。

4 內參基因的驗證

挑選出特定試驗條件下某物種中穩定表達的內參基因，可以對靶基因的RT-qPCR 試驗數據進行校正。在毛木耳內參基因篩選的試驗中，為了進一步驗證篩選結果，研究人員分別以軟件分析得出的最佳基因組合（PP2A+UBQ） 和穩定性最差的基因18S rRNA 為內參基因，對靶基因LAC 的相對表達量進行了分析驗證，結果顯示使用穩定性不同的內參基因對靶基因進行差異分析時，其結果差異顯著[12]。在香菇[8]、草菇[3]、平菇[9]、靈芝[5]、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）[28]、金針菇（Flammulina velutipes）[29]等研究中也出現了類似的現象。通過對不同的歸一化策略進行測試，證明使用未驗證的內參基因對RTqPCR 數據進行歸一化，可能會得到不準確的結論，從而對基因表達背后的生物現象造成誤解。因此，在特定的試驗條件下，篩選出穩定的內參基因是獲得可信的基因表達數據的前提。

5 建議

由于RT-qPCR 技術在基因表達分析中的諸多優點，目前已成為許多研究者開展食（藥） 用菌基因表達分析的主要技術。其中，根據試驗目的篩選出在特定條件下穩定表達的內參基因尤為重要。通過對食（藥） 用菌內參基因篩選研究進展進行整理，總結出以下幾點建議。

1） 建議根據所研究物種的轉錄組或表達譜數據來選擇候選內參基因，以便能粗略估計候選內參基因的表達量和穩定性。

2） 若所研究的物種已經有篩選內參基因的相關報道，可將報道中穩定性較好的內參基因作為候選基因，但不建議直接作為內參基因用于RT-qPCR數據分析，仍然需要根據即將開展的試驗對候選基因進行篩選和驗證。

3） 若缺乏轉錄組數據，也可選擇目前在食（藥） 用菌中研究次數較多且穩定性相對較好的傳統內參基因作為開展內參篩選研究的候選基因。

4） 建議選擇多種算法對候選基因進行分析排名。真正穩定性好的基因在所有算法中均趨于穩定，而穩定性較差的基因在不同軟件中的排名會有很大波動。

5） 使用geNorm 軟件分析可以確定最佳內參基因的數量，進而使用多個合適的內參基因對RTqPCR 的數據進行歸一化，從而保證靶基因表達分析的結果更加可靠。

6） 在即將開展的試驗條件下，對候選內參基因進行驗證分析，才能獲得準確的試驗結果，最終揭示基因差異表達背后所代表的生物學意義。