超聲法輔助提取內(nèi)蒙古甘草多糖工藝及其抗氧化活性研究

◎ 董 巍，王文豹，王曉麗，付 雙，野 津

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

甘草是我國傳統(tǒng)的“藥食同源”中草藥，為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflataBat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）的干燥根和根莖，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥功效[1]。由于甘草味甜，氣味芳香，常常作為食品調(diào)味料出現(xiàn)在多種烹飪方法中。現(xiàn)代研究表明，多糖作為甘草的主要活性成分之一，具有多種藥理學(xué)活性，表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血糖、抑制腫瘤生長等方面[2-6]。內(nèi)蒙古作為甘草的重要產(chǎn)區(qū)之一[7]，其具有品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量大、分布廣等特點，如何將內(nèi)蒙古甘草多糖進行合理的開發(fā)，對其提取工藝的研究及應(yīng)用價值的發(fā)揮至關(guān)重要，因而備受學(xué)者們的關(guān)注。

對于植物多糖的提取方法有很多種[8]，包括水溶劑提取法[9-10]、酶提取法[11]、微波提取法[12]、超臨界流體萃取法[13]、超聲輔助提取法[14]等。上述提取方法各有特點，溶劑提取法使用溶劑水作為溶媒，這種方法耗時較長、溫度較高、提取效率較低。酶提取法采用復(fù)合酶，由于酶對溫度要求較高，一旦溫度條件發(fā)生改變，在實驗過程中容易失活，導(dǎo)致多糖的結(jié)構(gòu)被破壞。近年，超臨界流體萃取法被作為提取多糖的新興方法，原理是利用流體兼有液體和氣體的特點，對很多物質(zhì)有很好的溶解能力，但是其設(shè)備復(fù)雜，運行成本高。超聲波輔助提取法，主要基于超聲波的特點，由于其具有機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，將多糖快速溶解于溶劑中，促進有效成分的溶出，反應(yīng)在室溫中進行，能夠有效節(jié)約能源。

本研究針對甘草多糖提取工藝進行探討，主要采用超聲輔助提取方式，先對單因素進行考察篩選，再利用正交設(shè)計進行整體優(yōu)化，獲得最佳工藝條件，以期為其在食品、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 藥材

甘草采購于哈爾濱市三棵樹中藥材市場，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院董巍副教授鑒定為豆科植物甘草的干燥根和根莖。

1.1.2 試劑

無水乙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；無水葡萄糖：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸：成都市科隆化學(xué)品有限公司；鐵氰化鉀：天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯乙酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯化鐵：天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉：蘇州誠杰精細(xì)化工有限公司；磷酸二氫鈉：蘇州博格瑞化工科技有限公司。

1.1.3 儀器

T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用有限責(zé)任公司；FA2004B 電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；GZX-9146MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LG16-W 離心機：北京醫(yī)用離心機廠；KQ-600V 型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SPARK 多功能酶標(biāo)儀：TECAN/帝肯。

1.2 方法

1.2.1 甘草多糖的提取

稱取適量甘草，粉碎過篩，加入適量的水進行超聲提取，超聲結(jié)束，經(jīng)過除蛋白后，加入無水乙醇使其濃度在80%以上，4 ℃醇沉24 h。將醇沉后的溶液離心，獲得甘草多糖。

1.2.2 甘草多糖的含量測定

甘草多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密稱取經(jīng)干燥后處理的葡萄糖對照品50 mg，并定容至50 mL 容量瓶中混勻，然后從其中量取5 mL，定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，即得0.1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 溶液，分別加入現(xiàn)配制5%苯酚溶液1 mL，并立即向其中加入濃硫酸5 mL，45 ℃水浴15 min，以490 nm 測定吸光度，以葡萄糖溶液濃度C橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制曲線，回歸方程為Y=54.914X+0.001 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

稱取甘草多糖粉末0.03 g，定容至250 mL 容量瓶中，然后從中精密量取1 mL 溶液加入10 mL 的具塞試管中，分別加入1 mL 蒸餾水、5%苯酚溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）1 mL 和5 mL 濃硫酸溶液，立即搖勻，45 ℃水浴15 min，在波長490 nm 處測定吸光度。按照公式（1）計算甘草多糖的提取率。

式中，C為內(nèi)蒙古甘草多糖樣品的濃度（g/mL），V為甘草多糖樣品的體積（mL），D為稀釋倍數(shù)。

1.3 單因素試驗

1.3.1 料液比對甘草多糖提取率的影響

稱取4 份甘草粉末，每份各10 g，分別考察4 個水平料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 ，超聲溫度為40 ℃，超聲時間為30 min，提取次數(shù)為1 次，對甘草多糖提取率的影響。

1.3.2 超聲溫度對甘草多糖提取率的影響

稱取4 份甘草粉末，每份各10 g，分別考察超聲溫度30、40、50、60 ℃ 4 個水平，超聲時間30 min，提取次數(shù)為1 次，料液比為1 ∶25，對甘草多糖提取率的影響。

1.3.3 超聲時間對甘草多糖提取率的影響

稱取4 份甘草粉末，每份各10 g，分別考察超聲時間20、30、40、50 min 4 個水平，超聲溫度60 ℃，提取次數(shù)為1 次，料液比為1 ∶25，對甘草多糖提取率的影響。

1.3.4 超聲次數(shù)對甘草多糖提取率的影響

稱取4 份甘草粉末，每份各10 g，分別考察超聲次數(shù)1 次、2 次、3 次、4 次4 個水平，料液比為1 ∶25，超聲溫度條件設(shè)置在60 ℃，超聲時間設(shè)定在30 min，對甘草多糖提取率的影響。

1.4 正交設(shè)計試驗

以料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）、超聲次數(shù)（D）為篩選因素，采用四因素三水平，以甘草多糖的提取率為衡量指標(biāo)，設(shè)計正交試驗L9（34）對甘草多糖的超聲提取工藝進行優(yōu)化。正交因素水平見表1。

表1 正交因素水平表

1.5 甘草多糖的抗氧化活性研究

采用普魯士蘭法[15]。分別精密吸取各組分濃度為0.16、0.31、0.63、1.25、2.5 mg/mL 的多糖及溶液2 mL，向其加入0.2 mol/L pH 為6.8 的磷酸鹽緩沖液1 mL 和1% 鐵氰化鉀溶液1 mL，混勻后在水浴50 ℃加熱20 min，冷卻，加入10% 三氯乙酸溶液1 mL，混勻后吸取1 mL 溶液于比色管中，加蒸餾水1 mL 和0.1%氯化鐵溶液0.5 mL，反應(yīng)10 min 后在波長700 nm 處測定吸光值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 分析數(shù)據(jù)并制圖，SPSS 25.0 設(shè)計正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對甘草多糖提取率的影響

料液比對甘草多糖的提取率作用程度見圖1，甘草多糖的提取率隨著料液比的降低，多糖提取率呈現(xiàn)整體上升的趨勢，當(dāng)料液比為1 ∶25 時，甘草多糖的提取率最高。開始料液比1 ∶10 時，多糖提取率較低，隨著料液比為1 ∶20，反應(yīng)體系中隨著溶劑的增加，甘草多糖的提取效果越來越顯著，當(dāng)料液比1 ∶25 時，反應(yīng)體系中多糖溶出達(dá)到最大程度，多糖提取率最高。

圖1 料液比對甘草多糖提取率的影響圖

2.1.2 超聲溫度對甘草多糖提取率的影響

超聲溫度對甘草多糖提取率影響結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出甘草多糖提取率明顯增加的趨勢，當(dāng)超聲溫度設(shè)置為30 ℃時，甘草多糖提取率為1.02%；當(dāng)超聲溫度設(shè)置為40 ℃，多糖提取率為1.43%；當(dāng)超聲溫度設(shè)置為60 ℃時，多糖的提取率大幅度提高，達(dá)到2.54%。超聲溫度的提高，促進了多糖分子的運動，極大地促進多糖的溶出速度，因而多糖的提取率較大。但是，對于超聲溫度也要進行嚴(yán)格控制，溫度過高會破壞多糖結(jié)構(gòu)。

圖2 超聲溫度對甘草多糖提取率的影響圖

2.1.3 超聲時間對甘草多糖提取率的影響

超聲時間對甘草多糖提取率影響結(jié)果如圖3 所示。超聲時間的不同，甘草多糖的提取率也會不同，甘草多糖整體呈現(xiàn)提取率先增大后減小。當(dāng)超聲時間設(shè)置為20 min，多糖的提取率較低；當(dāng)超聲時間設(shè)置為30 min，多糖的提取率達(dá)到10.02%；當(dāng)超聲時間設(shè)置為40 min 時，多糖的提取率下降。出現(xiàn)這種情況的原因是由于超聲的機械效應(yīng)較強，強烈的振動破壞甘草多糖的原有結(jié)構(gòu)。

圖3 超聲時間對甘草多糖提取率的影響圖

2.1.4 超聲次數(shù)對甘草多糖提取率的影響

超聲次數(shù)對甘草多糖提取率的影響結(jié)果如圖4 所示。甘草多糖的提取率隨著提取次數(shù)的增加，多糖提取率不斷增加。當(dāng)提取次數(shù)為3 次，多糖的提取率最大，達(dá)到10.24%；當(dāng)提取次數(shù)為1 次，甘草多糖溶出較低。隨著提取次數(shù)的增加，多糖溶出有增加，但是小幅度增加，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3 次時，多糖的提取率增加最多，但是當(dāng)提取次數(shù)為4 次，多糖的提取率下降，可能由于超聲的強大機械振動促使多糖的結(jié)構(gòu)被破壞，提取率下降。

圖4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響圖

2.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素考察的結(jié)果，確定以料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）、超聲次數(shù)（D）為試驗因素，采用四因素三水平，以甘草多糖的提取率為衡量指標(biāo)，確定甘草多糖的最佳提取工藝。試驗結(jié)果見表2。

表2 正交設(shè)計試驗結(jié)果表

從表2 中R值可知，對于甘草多糖提取率的影響程度分別是：超聲次數(shù)、超聲時間、超聲溫度、料液比，說明超聲次數(shù)對甘草多糖提取率的影響最大，其次是超聲時間、超聲溫度，料液比對甘草多糖提取率的影響最小，最佳超聲提取工藝條件是A2B3C2D3，這與正交試驗中提取率最高的組別不一致，因此進行驗證試驗。根據(jù)最佳超聲提取工藝條件進行驗證，按照最佳工藝條件A2B3C2D3，即料液比1 ∶20，超聲溫度60 ℃，超聲時間30 min，超聲次數(shù)3 次。進行3 次重復(fù)性試驗，多糖的提取率分別為11.48%、11.67%、12.04%，三者均高于正交設(shè)計，說明通過正交設(shè)計篩選出來的工藝條件為最佳工藝條件。驗證試驗結(jié)果見表3。

表3 驗證試驗結(jié)果表

2.3 甘草多糖的抗氧化活性結(jié)果

結(jié)果如圖5 所示。隨著濃度的升高，甘草多糖的抗氧化能力越來越強，并與其濃度呈正相關(guān)。當(dāng)濃度為2.5 mg/mL 時，抗氧化能力達(dá)到最強。

圖5 不同濃度甘草多糖對鐵離子還原能力測定效果圖

3 結(jié)語

本試驗首先探索單因素提取條件，然后結(jié)合正交設(shè)計確定超聲輔助提取甘草多糖的工藝條件，即料液比1 ∶20，超聲溫度60 ℃，超聲時間30 min，超聲次數(shù)3 次，甘草多糖的提取率為11.73%。同時，初步探索了其抗氧化活性，試驗證明甘草多糖具有一定的抗氧化活性。綜上所述，本研究對甘草多糖提取工藝方法進行優(yōu)化，并對抗氧化活性進行初步探索，以期為甘草多糖的合理利用和科學(xué)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。