血漿EBV DNA變化預測晚期胃癌化療近期療效的價值

彭麗香 黃晏驍 曾 頻 江長安 趙 鵬

胃癌居全國惡性腫瘤發病第2位,死亡第3位,據估計2014年新發胃癌病例41.0萬,死亡29.4萬,嚴重危害人民群眾健康[1]。我省2010年的統計數據亦表明,胃癌仍然是我省居民最主要的癌癥死因之一[2]。2014年,癌癥基因組圖譜研究(TCGA)項目組提出將胃癌分為4個亞型,EB(Epstein-Barr,EBV)病毒陽性型便是其中之一[3]。EB病毒陽性胃癌,占所有胃癌的9%,其特征包括PIK3CA頻發突變、PD-L1/2過表達、DNA超甲基化和免疫細胞信號轉導[3]。后來,Camargo MC等的研究證實EBV狀態與胃癌患者預后密切相關[4]。

1993年,Tokunaga M首次發現EBV存在胃癌細胞,認為其可能與胃癌發生發展有關,并將這一類胃癌命名為EBV相關胃癌[5]。與體內正常長鏈完整EBVDNA不同,癌癥患者血漿中EBV-DNA常為游離短DNA片段[6]。在鼻咽癌中血漿EBVDNA檢測分析用于早期無癥狀鼻咽癌的篩查[6];而放療中期血漿EBVDNA負荷可有效預測晚期鼻咽癌的療效,且放療后仍可檢測到EBV DNA的患者PFS和OS明顯更差[7]。

研究顯示,活檢組織中EBV編碼RNA(EBER) 的原位雜交(ISH)仍然是檢測EBV的金標準,且使用PCR測定EBV病毒載量在EBV相關疾病的診斷中越來越重要[8]。因此,本研究擬通過化療,觀察血漿EBV DNA在晚期胃癌患者的陽性率變化,基于此進一步探究血漿EBV DNA基礎值及化療后變化與化療近期療效間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

主要收集江西省腫瘤醫院2017年6月至2020年5月胃癌根治性手術切除樣本350例,均于10%中性福爾馬林緩沖液固定,石蠟包埋。男性患者209 例、女性患者141例,年齡32～79歲,中位年齡59歲。入組標準:經影像學和組織病理學確診為進展期的胃腺癌患者,≥18歲,ECOG行為評分0～2分,骨髓儲備功能好,無肝、腎、心、肺等重要臟器的嚴重損害,至少具備1個可測量病灶,初始接受姑息或新輔助化療。剔除條件:同時患鼻咽癌和淋巴瘤。

1.2 主要試劑

ELISA 試劑盒購自Rapidbio公司,熒光定量PCR試劑盒購自BioTeKe公司,原位雜交消化酶、EBER探針、PCR引物、DNA聚合酶、各清洗緩沖液、脫蠟液、液體封蓋膜、細胞處理液及其他常規試劑均購自美國羅氏公司。

1.3 方法

①EBV-RNA(EBVR)原位雜交法診斷胃癌組織中是否存在EBV(EBV診斷金標準):腫瘤組織石蠟包埋后3 μm厚度切片,60 ℃恒溫箱烤片2 h,Ventana BenchMark XT全自動染色儀進行全自動原位雜交檢測。檢測過程:組織脫蠟后經熱修復及酶消化,熒光素標記的探針與組織中特異的靶序列進行雜交,加入帶生物素的二抗與鏈酶親合素-堿性磷酸酶混合物結合,底物經顯色后產生藍色沉淀物。用已知陽性組織作為陽性外對照。

②PCR檢測胃癌患者基礎值和每2周化療前血漿EBV-DNA表達水平:化療前對患者給予外周血EBV-DNA的PCR檢測。檢測過程:細胞單獨培養或取不同的共培養細胞模型,待細胞生長至70%～80%后,更換無血清培養基饑餓24 h。加入100 nmol/L E2處理細胞12 h,各組調整DMSO至一致,最后分別得到對照組(ctrl)、E2處理組(E2),處理相應時間后立即終止藥物處理,用TRIzol 試劑提取各組細胞中總RNA,逆轉錄為cDNA。逆轉錄及PCR反應均按照TaKaRa試劑盒及熒光定量PCR試劑盒說明進行操作,直至獲得目標序列并定量,進而測得血漿EBV-DNA表達水平。實驗重復3次。

③為進一步研究血漿EBV DNA變化與化療療效的關系,將療效評價結果分為兩類:無進展組(包括完全緩解、部分緩解、疾病穩定)和進展組(疾病進展)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 原位雜交法及PCR檢測診斷EBV在晚期胃癌患者中的陽性率

350例胃腺癌患者組織切片經 EBV-RNA(EBVR)原位雜交法診斷胃腺癌組織中存在EBV陽性37例,陽性率為10.57%。

2.2 血漿EBV DNA基礎值及化療后變化

2.2.1 原位雜交法診斷的胃腺癌患者血漿EBV DNA陽性率化療后變化 37例經 EBV-RNA(EBVR)原位雜交法診斷胃腺癌組織中存在EBV陽性的胃腺癌患者血漿EBV DNA陽性率在化療進程中總體呈逐漸下降趨勢, 兩兩比較發現,化療每完成2周后,陽性率較前均明顯下降, 差異有統計學意義(表1)。

表1 每2周期化療前37例胃癌患者血漿EBV陽性變化

2.2.2 胃腺癌患者每2周期化療后EBV DNA陽性率與無進展人數變化 依據RECIST標準評價客觀療效后,顯示每2周期化療后37例胃腺癌患者中無進展人數(圖1)。在圖中化療2～6周期中血漿EBV DNA陽性率降幅最大,而無進展人數降幅最小,且血漿EBV DNA陽性率與無進展人數具有相關性(圖2)。

注:主坐標為人數,次坐標為陽性率。

圖2 胃腺癌患者EBV DNA陽性率變化與無進展人數的相關性

3 討論

胃癌的主要部分與多種致病性感染有關,包括但不限于幽門螺桿菌(H. pylori)或EB病毒(EBV)[9]。

腫瘤微環境(TME)由腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞等細胞外成分組成,對腫瘤進展和治療耐藥性起著舉足輕重的作用,這些基質細胞通過釋放各種分子直接激活癌細胞中的生長信號或重塑周圍區域來促進腫瘤生長[10-11]。例如,在GC中,PD-L1表達與不同的臨床病理特征相關,包括高密度TILs,MMR缺乏和EBV陽性[12]。

研究顯示,EBV陽性胃腺癌患者在化療初期存在血漿EBV DNA轉陰,而2～4個周期后復陽現象,如表1所示,而在該類患者中有部分存在遠處轉移情況。本研究還發現,在37例EBV陽性胃腺癌患者中存在合并幽門螺桿菌感染的患者,其中包含了5例進展患者,雖然人數較少,但在相同條件下化療后其血漿EBV DNA的降幅明顯小于其它未感染幽門螺桿菌胃癌患者。當然,幽門螺桿菌感染患者的EBV DNA拷貝數顯著較高,幽門螺桿菌陽性個體中EBV DNA載量增加的趨勢表明幽門螺桿菌在調節EBV向裂解期的轉化中可能起作用,同時,在GC中存在Hp的情況下,基于添加EBV的協同效應產生的估計風險增加了26倍[13]。同一腫瘤內的多種病毒感染可能會影響TME[14]。然而,是否存在兩者共同作用的因素導致腫瘤細胞的耐藥性或促進EBV的表達這個不得而知。本次實驗的相關人數較少,僅僅單獨研究其相關性可能不妥,因此很難判斷其是否具有相關性,當然這或許也符合上述的腫瘤發生和發展存在多因素影響。

不少研究表明,EBV 感染導致的疾病種類多樣,不同標本類型都可以給臨床提供有價值的診療信息,不同疾病應選擇不同樣本以實現EBV感染的準確診斷[15],因此,一旦晚期胃癌伴轉移,在行姑息性手術后其他轉移處只能行化療處理,而其化療效果尚不可控,此刻只檢測血漿內EBV DNA量會在一定程度上影響本次研究的穩定性。當然,在以后的研究里還可以通過使用定量方法(如qPCR)測試EBV相關基因的表達來獲得額外的信息和對患者病情的更好評估[16]。除此之外,本研究還進一步發現,胃腺癌患者在實施腫瘤切除及化療后,飲食功能、消化功能也相繼明顯下降,繼而導致免疫功能進一步下降,患者也較易發生急性呼吸道感染,而該類患者的EBA DNA表達也有較為明顯的波動。我們知道,TME是通過募集和分化免疫抑制和/或抗炎細胞[如調節性T細胞(Tregs)、Th17細胞、樹突狀細胞(DC)、M2腫瘤相關巨噬細胞(TAM)和髓源性抑制細胞(MDSC)]以及抑制免疫效應細胞(如NK細胞和CD8 T淋巴細胞)發揮核心作用[17],而急性呼吸道感染可能會影響體內TME,然目前暫未發現有此類相關研究。這個情況對于本實驗研究也會有些許影響。然而,此類情況雖不可避免,但是經實驗室及影像學檢查顯示的腫瘤進展尚未見到明顯影響。