基于miR-152-3p/Wnt軸辣椒素對乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞株LCC9耐藥的作用機制

孫 星 劉 越 趙得堡 盛 晶 劉揚帆 劉麗娜 屈中玉 萬里新

乳腺癌因其發病率呈逐年上升趨勢,且趨于年輕化的特點嚴重威脅著女性的生命健康。臨床上常采用手術切除、內分泌治療以及放化療等手段治療乳腺癌,內分泌治療是雌激素受體陽性乳腺癌患者綜合治療的重要部分[1]。他莫西芬是一種抗雌激素受體類藥物,因具有低毒、經濟以及效應作用持久等特點而成為雌激素受體陽性乳腺癌患者內分泌治療的一線藥物,但臨床應用發現耐藥性是導致治療效果不理想的重要原因之一,因此解決他莫西芬耐藥性是治療雌激素受體陽性乳腺癌患者的關鍵所在[2]。辣椒素是從辣椒中提取的生物活性成分,研究發現,辣椒素具有抗腫瘤活性,可降低膀胱癌、食管鱗癌以及肝癌等多種惡性腫瘤的增殖和浸潤能力[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度在25 nt范圍內的小分子非編碼RNA,miR-152-3p在乳腺癌組織中低表達,且與乳腺癌細胞的侵襲和轉移密切相關[4]。Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路異常激活在乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲過程中發揮重要作用[5]。基于以上研究,本研究探討辣椒素是否能通過miR-152-3p調節Wnt/β-catenin信號通路逆轉乳腺癌細胞對他莫西芬的耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 MCF-7細胞和他莫西芬耐藥LCC9細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 試劑和儀器 辣椒素(純度≥98%)購自美國Sigma公司;mimic NC、mimic、inhibitor NC和inhibitor由海上吉瑪制藥技術有限公司合成;PCR引物購自廣州銳博生物科技有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;兔抗人β-連環蛋白(β-catenin)、T細胞因子4(T-cell factor,TCF4)以及GAPDH 抗體購自美國Abcam公司;酶標儀購自美國Bio-Rad公司;熒光定量PCR儀購自美國Thermofisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將復蘇后的MCF-7細胞和LCC9細胞培養于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中,置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養,每天更換一次培養基,細胞達到80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 CCK8法檢測不同濃度辣椒素對LCC9細胞存活率的影響 取對數生長期LCC9細胞,制成密度為5×105個/mL的細胞懸液,接種于96孔板,每孔200 μL,待細胞貼壁生長后,加入不同濃度辣椒素(0、50、100、200、400 μmol/L),每個濃度設置3個復孔,置于培養箱中培養24 h后,每孔加入10 μL CCK8液,重新孵育2 h,酶標儀570 nm波長處測定吸光度(A)值。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-152-3p和Wnt1 mRNA相對表達量 取對數生長期細胞,PBS清洗2次,胰蛋白酶消化收集細胞,加入Trizol試劑提取細胞中總RNA,紫外分光光度計測定RNA濃度和純度,將RNA逆轉錄成cDNA,以cDNA為模板,采用SYBR Green PCR Master Mix進行熒光定量PCR,反應條件為:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,進行40個循環,引物序列見表1。2-△△CT法計算miR-152-3p和Wnt1 mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.2.4 細胞分組與轉染 取對數生長期LCC9細胞,制成密度為5×105個/mL的細胞懸液,接種于96孔板,每孔200 μL,待細胞貼壁生長后,將細胞隨機分為對照組、inhibitor NC組、inhibitor組和inhibitor+辣椒素組,除對照組外,其余組分別轉染inhibitor NC、inhibitor,inhibitor+辣椒素組細胞轉染inhibitor 12 h后,加入200 μmol/L辣椒素處理24 h。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞存活率 PBS清洗各組細胞2次,胰蛋白酶消化,加入PBS重懸后離心,加入500 μL結合緩沖液,并分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μL,避光充分震蕩混勻,反應20 min后置于流式細胞儀上測定細胞凋亡率。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-152-3p和Wnt1的靶向關系 根據Targetscan軟件預測miR-152-3p與Wnt1 3'UTR區存在互補核苷酸序列,構建野生型(Wt)和突變型(Mut)Wnt1 3' UTR熒光酶載體,根據脂質體2000說明書將Wt Wnt1和Mut Wnt1分別與miR-152-3p mimic和mimic NC共轉染入LCC9細胞,48 h后測定熒光素酶相對活性。

1.2.7 蛋白印跡法檢測β-catenin和TCF4蛋白相對表達量 離心收集LCC9細胞,裂解液裂解,離心收集上清液,BCA法測定蛋白濃度。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,120 V電泳2 h,0.3 A濕轉2 h,室溫封閉1.5 h,β-catenin、TCF4以及GAPDH抗體(1∶1000)4 ℃冰箱過夜,二抗(1∶5000)室溫孵育2 h,ECL顯色,Image J分析灰度值,目的條帶灰度值與內參灰度值的比值為目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度辣椒素對細胞存活率的影響

細胞存活率隨辣椒素濃度的升高而降低,且具有濃度依賴性(P<0.05),見表2。

表2 不同濃度辣椒素對細胞存活率的影響

2.2 LCC9細胞中miR-152-3p和Wnt1表達水平檢測結果

LCC9細胞中miR-152-3p表達水平較MCF-7細胞降低,而Wnt1 mRNA相對表達量較MCF-7細胞升高(P<0.05),見表3。

表3 miR-152-3p和Wnt1 mRNA相對表達量比較

2.3 qRT-PCR檢測結果

miR-152-3p相對表達水平組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組和inhibitor NC組比較,inhibitor組miR-152-3p相對表達水平降低(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組miR-152-3p表達水平升高(P<0.05)。對照組和inhibitor NC組miR-152-3p相對表達水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組miR-152-3p相對表達水平比較

2.4 CCK8法檢測結果

細胞存活率組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組細胞存活率降低(P<0.05)。對照組、inhibitor NC組和inhibitor組細胞存活率比較,差異無統計學意義(P>0.05);見表5。

表5 各組細胞存活率比較

2.5 流式細胞儀檢測結果

細胞凋亡率組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組和inhibitor NC組比較,inhibitor組細胞凋亡率降低(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組細胞凋亡率升高(P<0.05)。對照組和inhibitor NC組細胞凋亡率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表6,圖1。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

表6 各組細胞凋亡率比較

2.6 雙熒光素酶報告基因法檢測結果

雙熒光素酶報告實驗結果顯示:miR-152-3p mimic+Wt-Wnt1組熒光素酶相對活性降低(P<0.05)。見表7,圖2。

圖2 Wnt1和miR-152-3p結合位點及突變位點

表7 雙熒光素酶相對表達活性

2.7 蛋白印跡法檢測結果

β-catenin和TCF4蛋白相對表達量組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組和inhibitor NC組比較,inhibitor組β-catenin和TCF4蛋白相對表達量升高(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組β-catenin和TCF4蛋白相對表達量降低(P<0.05)。對照組和inhibitor NC組β-catenin和TCF4蛋白相對表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表8、圖3。

圖3 蛋白印跡法檢測細胞中各蛋白表達情況

表8 各組β-catenin和TCF4蛋白相對表達量比較

3 討論

臨床上將乳腺癌分為四型,即Luminal A、Luminal B、HER過表達型以及三陰性乳腺癌,其中雌激素受體陽性即Luminal型乳腺癌占到75%左右[6]。他莫西芬是一種人工合成的結構類似于雌激素的非甾體類抗雌激素藥,通過與雌激素競爭性結合雌激素受體,從而阻斷雌激素發揮生物學效應,達到抑制乳腺癌細胞增殖的目的[7],而他莫西芬耐藥成為乳腺癌治療失敗的主要原因之一。因此本研究以他莫西芬耐藥細胞LCC9為研究對象,探討辣椒素對耐藥性的影響及其具體機制。

研究發現,辣椒素可降低乳腺癌細胞的增殖活性,誘導G2/M細胞周期阻滯,從而阻礙乳腺癌的發生發展[8]。Li等[9]研究發現,辣椒素下調MMP2和MMP9表達,抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲。本研究種不同濃度辣椒素處理LCC9細胞,結果顯示:隨著辣椒素濃度的升高,細胞存活率逐漸降低。由此可見,辣椒素可抑制他莫西芬耐藥細胞LCC9的增殖活性。研究表明,乳腺癌組織和細胞中miR-152-3p表達顯著高于正常組織和細胞,上調miR-152-3p可增強乳腺癌細胞對化療藥物紫杉醇的敏感性,誘導癌細胞凋亡[10]。Ge等[11]研究發現miR-152-3p通過負向調控PI3K/Akt信號通路在乳腺癌中發揮抑癌作用。本研究通過檢測MCF-7細胞和LCC9細胞中miR-152-3p的表達水平發現,他莫西芬耐藥細胞株LCC9中miR-152-3p表達水平較MCF-7細胞顯著降低。為進一步探討辣椒素抑制LCC9細胞增殖是否是通過調節miR-152-3p表達實現的,本研究通過將miR-152-3p inhibitor轉染入LCC9細胞,同時用辣椒素處理細胞,結果顯示:與inhibitor NC組比較,inhibitor組miR-152-3p表達水平降低,與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組miR-152-3p表達水平升高,說明成功敲降LCC9細胞中miR-152-3p表達,辣椒素可上調miR-152-3p表達水平。CCK8和流式細胞儀檢測結果顯示:與inhibitor NC組比較,inhibitor組細胞凋亡率降低,與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組細胞存活率降低,細胞凋亡率升高,說明辣椒素通過上調miR-152-3p表達誘導乳腺癌細胞凋亡,降低癌細胞增殖活性。

Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤細胞增殖、分化和侵襲過程中發揮重要作用,該信號通路關鍵蛋白發生突變,導致該通路異常激活可能誘導癌癥發生。β-catenin是Wnt信號通路中關鍵的信號樞紐,一般情況下處于低水平狀態,一旦Wnt信號通路被激活,β-catenin降解減少,在細胞質中大量聚集并進入細胞核與TCF4結合形成轉錄復合物,從而誘導下游靶基因表達,參與腫瘤的發生發展[12]。研究發現,Wnt/β-catenin信號通路在乳腺癌中被異常激活,促進乳腺癌細胞上皮間質轉化,抑制細胞凋亡[13]。Sun等[14]研究發現miR-152-3p上調可抑制Wnt/β-catenin信號通路從而在結直腸癌中發揮抗癌作用。本研究雙熒光素酶報告試驗結果表明miR-152-3p可直接靶向作用于Wnt1。蛋白印跡法實驗結果顯示:與inhibitor NC組比較,inhibitor組β-catenin和TCF4蛋白表達升高,與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組β-catenin和TCF4蛋白表達降低,結果說明:辣椒素通過上調miR-152-3p可抑制Wnt/β-catenin信號通路。

綜上所述,辣椒素可降低乳腺癌他莫西芬耐藥細胞LCC9的增殖活性,誘導癌細胞凋亡,其可能是通過上調miR-152-3p表達,從而抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮作用,為臨床治療乳腺癌提供理論依據。