七氟醚對肺癌細胞生物學行為及對小鼠肺癌細胞肺轉移的影響及可能作用機制

王俊鵬 魏 紅 孫 凱

作者單位：450003 鄭州大學第二附屬醫院

肺癌是癌癥相關死亡的主要原因,根據組織病理學特征,主要分為非小細胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLS)和小細胞肺癌,其中包括鱗狀細胞癌、大細胞癌和腺癌在內的NSCLC占原發性肺癌的80%以上[1],并以高轉移和高死亡率為特征的肺腺癌(lung adenocarcinoma,LAC)為主要亞型[2]。研究表明,肺癌轉移與超過70%的死亡有關[3],研究肺癌轉移機制,尋找有效治療靶點,對臨床藥物研發、應用及提高患者生存率將具有重要意義。上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)是從上皮表型到間充質表型的動態過渡狀態,在腫瘤侵襲和轉移中起重要作用[4]。研究發現,轉化生長因子β (transforming growth factor β,TGF-β)在NSCLC細胞中高度表達,增強TGF-β/Smad信號可有效地促進LAC中的EMT和腫瘤轉移[5],提示TGF-β/Smad通路可能是肺癌治療的潛在靶點。越來越多的證據表明,包括麻醉劑在內的圍手術期因素會影響手術后的癌癥復發和轉移,其中揮發性麻醉劑七氟醚已被證明可抑制肺癌細胞的增殖、侵襲并誘導凋亡[6],但關于其是否可介導TGF-β/Smad通路影響肺癌細胞的惡性生物學行為及小鼠體內肺轉移的相關報道較少,故本研究擬體外培養小鼠LAC Lewis細胞株,經不同濃度七氟醚暴露,觀察體外Lewis肺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲變化及小鼠體內肺癌轉移情況,并檢測相關指標因子表達以探討其可能作用機制,以期為肺癌治療靶點及臨床藥物研發提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 小鼠Lewis肺癌細胞(CL-0140)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 實驗動物 6周齡SPF級C57BL/6小鼠32只,體質量(20±2)g,雌雄各半,購自長沙市天勤生物技術有限公司,許可證號為SCXK(湘)2019-0014。恒溫(24±2)℃、恒濕(相對濕度50%～60%)環境下普通飼養,給予充足水和普通飼料,12 h光照與12 h黑暗交替,適應性培養1周。

1.1.3 試劑和儀器 Matrigel基質膠(354248)購自美國Corning公司;AnnexinV-FITC/PI試劑盒(E-CK-A211)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;TGF-β1(ab92486)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)(ab181296)、鋅指蛋白Snail(ab216347)抗體購自美國Abcam公司;波形蛋白(Vimentin,Vim)(bs-8533R)抗體購自北京博奧森生物科技有限公司;N-鈣黏蛋白(N-cadherin,N-cad)(PAB17213)、Smad2/3(ABP52462)、Smad7(3670-100)抗體購自武漢艾美捷生物科技有限公司;p-Smad2/3(K25210)抗體購自北京百奧萊博生物科技有限公司;TβRⅠ(ENT4627)抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;BI 7300型實時熒光定量PCR系統購自美國ABI公司;550型全自動酶標儀、Gel Doc XR+凝膠成像分析系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及七氟醚暴露 DMEM完全培養液(含10%胎牛血清+100 μg/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素)復蘇并培養Lewis肺癌細胞,于培養箱參數為37 ℃、5% CO2的加濕環境下培養,當細胞鋪至80%左右,利用胰蛋白酶消化傳代。選擇傳代2～3次后的Lewis肺癌細胞于培養瓶中培養至70%密度左右,分別放置于37 ℃恒溫水浴箱中的無菌密閉氣體室內,利用封閉箱出口處氣體監測儀校準七氟醚濃度:①細胞僅通入0.5 L/min 95% O2和5% CO2混合氣體;②細胞通入0.5 L/min 95% O2和5% CO2混合氣體并通過揮發罐攜帶0.75%濃度七氟醚;③細胞通入0.5 L/min 95% O2和5% CO2混合氣體并通過揮發罐攜帶1.5%濃度七氟醚;④細胞通入0.5 L/min 95% O2和5% CO2混合氣體并通過揮發罐攜帶3%濃度七氟醚。均暴露培養4 h。

1.2.2 CCK8法檢測不同濃度七氟醚對Lewis肺癌細胞的增殖抑制作用 經氣體暴露培養4 h后,胰蛋白酶消化并收集細胞,DMEM完全培養液重懸,以每孔1×104個/mL細胞密度接種100 μL至96孔板中培養24 h(各設5個復孔),加入10 μL CCK8溶液,培養箱內靜置孵育2 h,450 nm處測定吸光度(OD)值,細胞存活率(%)=七氟醚組OD值/無七氟醚組OD值×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測Lewis肺癌細胞凋亡率 經氣體暴露培養4 h后放回培養箱中繼續培養細胞24 h,胰蛋白酶消化法收集各組細胞,預冷PBS洗滌2遍,3000 r/min離心5 min,100 μL×結合緩沖液重懸,5 μL Annexin V-FITC溶液和5 μL PI溶液室溫避光染色10 min,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率,重復3次。

1.2.4 傷口愈合實驗檢測Lewis肺癌細胞遷移能力細胞經氣體暴露培養4 h,無菌20 μL移液槍頭垂直于細胞表面制造劃痕,PBS洗滌,繼續培養24 h。在劃痕0 h和24 h時拍照,ImageJ軟件測量劃痕寬度,劃痕愈合率評估細胞遷移能力,其中劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。重復3次。

1.2.5 Transwell實驗檢測Lewis肺癌細胞侵襲能力經氣體暴露培養4 h后,收集細胞,利用無血清培養液以每孔5×104個細胞接種至Transwell 24孔板上室(涂布Matrigel基質膠),下室加入1 mL DMEM完全培養液,于培養箱內培養24 h后,棉簽拭去未侵入細胞,甲醇固定上室下表面細胞15 min,結晶紫染色后鏡下隨機選取5個視野,計數視野中的平均細胞數。重復3次。

1.2.6 小鼠體內Lewis肺癌細胞轉移檢測 細胞經不同濃度七氟醚(0、0.75%、1.5%、3%)氣體暴露培養4 h后,酶消化法收集,并調整細胞密度為2×107個/mL;經尾靜脈注射100 μL細胞懸液于小鼠體內,每個濃度組各8只,常規普通飼養21 d。脫頸法處死各組小鼠,解剖并收集完整肺組織,后于Bouin固定液中固定24 h,無水乙醇浸泡至肺組織顏色恢復,轉移灶為白色結節,解剖顯微鏡下計數肺癌轉移灶的數目(轉移灶為類圓形小突起呈結節狀,呈圓形半透明點狀2～ 5 mm,部分轉移灶可融合在一起)。肺轉移抑制率(%)=(對照組平均肺表面轉移灶數-七氟醚組平均肺表面轉移灶數)/對照組平均肺表面轉移灶數×100%[7]。

1.2.7 RT-qPCR技術檢測Lewis肺癌細胞中EMT相關因子mRNA表達情況 細胞經不同濃度七氟醚(0、0.75%、1.5%、3%)氣體暴露培養4 h后,酶消化法收集,Trizol法提取各濃度下Lewis肺癌細胞總RNA,測定RNA純度及濃度后逆轉錄為cDNA,制備RT-qPCR反應體系并進行定量檢測。反應條件為95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 40個循環;72 ℃ 5 min。以GAPDH為內參基因,2-ΔΔCT法量化mRNA表達水平。引物序列如下:E-cad:F:5'-GACCG AGAGAGTTTCCCTACG-3'、R:5'-TCAGGCACCTGACCCTTGTA-3';N-cad:F:5'-GAGATCCTACTGGACGGTTCG-3'、R:5'-TCTTGGCGAATGATCTTAGGA-3';Vim:F:5'-CCTTGAACGCAAAGTGGAATC-3'、R:5'-TGAGGTCAGGCTTGGAAACAT-3';Snail:F:5'-CTGCGGGAAGG-CCTTCTCT-3'、R:5'-CGCCTGGCACTGGTACTTCTT-3';GAPDH:F:5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'、R:5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'。

1.2.8 Western blot技術檢測Lewis肺癌細胞中TGF-β通路及EMT相關蛋白表達情況 細胞經不同濃度七氟醚(0、0.75%、1.5%、3%)氣體暴露培養4 h后,酶消化法收集,預冷PBS洗滌2遍,于RIPA裂解液中裂解,離心后取上清。BCA法測定蛋白濃度,加熱變性,加等量蛋白樣品于SDS-PAGE凝膠中進行分離,并濕轉至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉,一抗內4 ℃孵育過夜,洗膜,辣根過氧化物酶偶聯的二抗內室溫孵育2 h,洗膜,PVDF膜與ECL發光溶液反應顯影,凝膠成像系統成像并使用Image J軟件量化,以目的蛋白與內參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達量。重復3次。

1.3 統計分析

2 結果

2.1 七氟醚對Lewis肺癌細胞增殖的影響

Lewis肺癌細胞存活率隨七氟醚作用濃度增大而降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細胞存活率比較

2.2 七氟醚對Lewis肺癌細胞凋亡的影響

Lewis肺癌細胞凋亡率隨七氟醚作用濃度增大而升高(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細胞凋亡情況

表2 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細胞凋亡率比較

2.3 七氟醚對Lewis肺癌細胞遷移的影響

Lewis肺癌細胞劃痕愈合率隨七氟醚作用濃度增大而降低(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 各組Lewis肺癌細胞遷移情況(×100)

表3 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細胞劃痕愈合率比較

2.4 七氟醚對Lewis肺癌細胞侵襲的影響

Lewis肺癌細胞侵襲數隨七氟醚作用濃度增大而減少(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 各組Lewis肺癌細胞侵襲情況(×200)

表4 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細胞侵襲數比較

2.5 七氟醚對小鼠Lewis肺癌細胞肺轉移的影響

小鼠Lewis肺癌細胞轉移灶數隨七氟醚作用濃度增大而減少,轉移抑制率隨七氟醚作用濃度增大而升高(P<0.05)。見表5。

表5 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細胞轉移灶數及轉移抑制率比較

2.6 七氟醚對Lewis肺癌細胞EMT相關基因表達的影響

Lewis肺癌細胞中E-cad mRNA相對表達量隨七氟醚作用濃度增大而升高,N-cad、Vim及Snail mRNA相對表達量隨七氟醚作用濃度增大而降低(P<0.05)。見表6。

表6 Lewis肺癌細胞EMT相關基因相對表達量比較

2.7 七氟醚對Lewis肺癌細胞中TGF-β通路及EMT相關蛋白表達的影響

Lewis肺癌細胞中TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2/3蛋白及N-cad、Vim、Snail蛋白相對表達量隨七氟醚作用濃度增大而降低,Smad7和E-cad蛋白相對表達量隨七氟醚作用濃度增大而升高(P<0.05)。見圖4,圖5,表7,表8。

注:A:無七氟醚組;B:0.75%七氟醚組;C:1.5%七氟醚組;D:3%七氟醚組。

表7 Lewis肺癌細胞TGF-β通路相關蛋白相對表達量比較

表8 Lewis肺癌細胞EMT相關蛋白相對表達量比較

3 討論

七氟醚作為一種揮發性麻醉劑,廣泛用于肺癌外科手術,因有大量臨床數據支持其安全性,關于其對腫瘤和器官系統的生物學效應以及所涉及的分子機制的相關研究逐漸深入[8]。據報道,七氟醚預處理肺癌A549細胞30 min可改變幾種凋亡相關的miRNA,提高細胞凋亡率,減少癌細胞數量[9],另可通過細胞分化及代謝相關通路減輕LAC的惡性生物學行為、順鉑耐藥和體內致瘤性[10]。本研究利用不同濃度七氟醚作用LAC Lewis細胞,并將作用后的細胞注入小鼠體內進行肺轉移實驗,結果顯示,七氟醚可呈濃度依賴性降低Lewis肺癌細胞存活率、劃痕愈合率、侵襲細胞數及小鼠肺內轉移灶數,并提高細胞凋亡率及轉移抑制率,說明七氟醚可抑制肺癌細胞體外惡性生物學行為,對小鼠體內肺癌細胞的轉移也具有積極的抑制意義,提示其對肺癌患者的癌細胞轉移性惡性進展可能具有一定的干預效果,但其涉及的具體機制還需進一步探究。

與原發腫瘤本身的影響相比,轉移灶中癌細胞的破壞性擴散對肺癌相關死亡的影響最大,而EMT與腫瘤轉移高度相關[11]。一般來說,EMT是上皮細胞通過一系列基因表達調控作用如轉錄調節因子Snail轉化為間充質表型細胞的病理生理過程,并伴隨一系列生物學事件,如上皮標志物E-cad蛋白表達降低,而N-cad和Vim的表達增加,表現出多種間充質細胞特性,遷移和侵襲潛力增強[12]。E-cad負責細胞粘附和細胞骨架組織,其丟失是EMT過程中的關鍵步驟,導致上皮細胞轉變為侵襲性間充質細胞[13];Vim、N-cad為間充質細胞標志物,二者表達上調與肺癌的惡性進展密切相關[14];Snail是EMT的關鍵轉錄因子,已被發現可促進腫瘤上皮細胞向基質細胞轉化,增強腫瘤細胞的運動和侵襲能力并促進細胞遷移,研究表明,敲低Snail可逆轉EMT表型,下調N-cad和Vim,上調E-cad,可降低非小細胞肺癌的侵襲和遷移能力[15]。本研究結果顯示,經七氟醚作用后,Lewis肺癌細胞中Snail、Vim及N-cad mRNA和蛋白相對表達水平均降低,E-cad mRAN和蛋白相對表達水平均升高,提示七氟醚可能通過抑制EMT進展而抑制肺癌細胞的惡性生物學行為及小鼠體內肺癌細胞的肺轉移。

TGF-β誘導的EMT是腫瘤細胞侵襲和轉移的一個主要特征,其中TGF-β1信號控制細胞增殖、分化、凋亡和遷移,據報道,在健康細胞和癌前細胞中,TGF-β1主要作為腫瘤抑制因子發揮作用,而在癌癥晚期,TGF-β1信號傳導促進腫瘤侵襲和轉移[16],其中TGF-β1/Smad2/3信號通路激活可促進肺癌EMT[17]。TGF-β1與其受體TβR結合形成跨膜復合物,其下游Smad2/3蛋白被磷酸化并與Smad4結合形成相對穩定的三聚體復合物易位至細胞核,通過與相關轉錄因子的協同作用共同調節EMT過程靶基因的轉錄,Smad7對該過程具有抑制作用[18]。Xue等[19]研究發現,TGF-β1可通過Smad2、Smad3和Smad4作用誘導下游靶基因Snail1易位進入細胞核,與E-cad啟動子結合并抑制E-cad的轉錄,進而導致EMT中E-cad丟失,通過激活TGF-β1/Smad/Snail通路可促進肺癌EMT;抑制TGF-β1/Smad信號通路可抑制Lewis肺癌細胞的惡性進展[20]。本研究結果顯示,經七氟醚作用后,TGF-β1、TβRⅠ及p-Smad2/3蛋白相對表達水平降低,Smad7蛋白相對表達水平升高,提示TGF-β1/Smad2/3通路被抑制,結合上述EMT相關因子表達情況,提示七氟醚可能通過抑制TGF-β1/Smad2/3通路激活,降低其下游靶基因Snail的細胞核含量,減少其于核內與E-cad啟動子的結合和EMT中E-cad的丟失,減緩EMT進展,進而減弱癌細胞的惡性增殖、遷移及侵襲能力,并發揮體內抗癌細胞肺轉移作用。

綜上所述,七氟醚可誘導肺癌細胞凋亡,抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲及癌細胞在小鼠體內的肺轉移,其作用機制可能與抑制TGF-β1/Smad通路激活進而減緩EMT進程有關。