基于轉錄組學的Vip3Aa殺美洲大蠊的作用機制研究

和夢穎,黎爾彤,田方圓,汪 潔,金小寶,劉文彬

(廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室,廣州 510006)

Vip是蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis營養期產生的一類殺蟲蛋白(Guptaetal., 2021)。目前已發現4大類Vip蛋白,分別是Vip1、Vip2、Vip3和Vip4蛋白。Vip1和Vip2蛋白可用于鞘翅目昆蟲的防治,Vip4蛋白的功能尚不清楚,而Vip3蛋白研究最為廣泛,可用于鱗翅目昆蟲等的防治。在鱗翅目昆蟲中,Vip3Aa在中腸被蛋白酶水解去除N端蛋白形成毒性蛋白,毒性蛋白與昆蟲的刷狀緣膜囊泡(Brush border membrane vesicle, BBMV)結合,導致BBMV形成空洞,最終引發昆蟲的死亡(Zhangetal., 2018),但其確切分子機制尚不清楚。

Vip3Aa蛋白可誘導真菌細胞和鱗翅目昆蟲細胞的凋亡。有研究者對甜菜夜蛾Spodopterafrugiperda幼蟲取食Vip3Aa蛋白的多個基因進行Q-PCR后發現,Vip3Aa可誘導甜菜夜蛾幼蟲Caspase-1、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-6和JAK-STAT等凋亡相關基因的上調,并且通過TUNL染色觀察到中腸出現凋亡細胞的存在,推測Vip3Aa作用可能與凋亡相關(Hernández-Martínezetal., 2017)。Hou等(2020)的研究中發現Vip3Aa蛋白可誘導甜菜夜蛾Sf9細胞的凋亡,其中溶酶體在其中扮演了重要作用。Park等(2021)發現Vip3Aa蛋白可通過促進線粒體活性氧的生成和與核酸的結合誘導白念珠菌Candidaalbicans細胞的凋亡。

前期研究發現Vip3Aa蛋白可破壞美洲大蠊Periplanetaamericana的中腸上皮結構從而導致其死亡,且發現美洲大蠊BBMV缺乏Vip3Aa蛋白受體,Vip3Aa蛋白并不會與美洲大蠊BBMV結合,因此也表明Vip3Aa蛋白殺美洲大蠊機制有別于殺鱗翅目昆蟲機制(Liuetal., 2020)。轉錄組測序結果代表了基因組的實時表達情況,通過對不同狀態差異基因(DEGs)的挖掘,可為探索相關機制的研究奠定基礎,如王登杰(2015)采用轉錄組學比較了煙粉虱Bemisiatabaci是否感染球孢白僵菌Beauveriabassiana的差異基因,上述基因富集在76個主要通路,為深入研究煙粉虱對球孢白僵菌感染的免疫反應提供了基礎,姚知含等(2015)的研究中采用轉錄組學研究了沙蔥螢葉甲Galerucadaurica對蛻皮激素的響應,發現蛻皮激素可通過核黃素代謝、溶酶體和泛酸與乙酰輔酶A合成通路調控沙蔥螢葉甲的生殖滯育。昆蟲的腸道是保護宿主的第一道屏障(Terraetal., 2018),前期研究發現Vip3Aa蛋白的主要損傷部位在中腸,因此本研究比較了美洲大蠊取食Vip3Aa蛋白的轉錄組學變化,并通過實驗驗證,初步探討Vip3Aa殺美洲大蠊的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

美洲大蠊由廣東省疾病預防控制中心陰偉雄高級技工饋贈。美洲大蠊飼養于本研究所昆蟲室,飼養溫度20～30℃,相對濕度65%～75%,飼料為鼠糧。

1.2 主要試劑和儀器

PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒購于日本Takara公司;Trizol購于美國英濰捷基公司;DEPC購于美國Sigma-aldrich公司;RNAStore樣本保存液購于天跟生化科技有限公司。TGrinder電動組織勻漿機、TGem Plus全波長分光光度計(天根生化科技有限公司);CFD-3120熒光定量PCR(美國伯樂公司);LKB-5型超薄切片機(瑞典LKB公司)。

1.3 給藥與取樣

取6頭美洲大蠊成蟲,隨機分為對照組和給藥組,每組3頭。分組后,美洲大蠊均投放于適量溶液的培養皿,對照組為PBS溶液,給藥組為0.031 mg/ml Vip3Aa蛋白PBS溶液,給藥后24 h,冰浴麻醉美洲大蠊,用手術剪小心分離中腸,并將其保存于RNAStore樣本保存液。

1.4 中腸總mRNA的提取、cDNA合成和測序

將中腸組織置入DEPC預處理的研缽,加入適量液氮,研磨粉碎,加入50～100 mg/mL Trizol充分裂解樣品。12 000 rpm離心5 min取上清,加入1/5 Trizol體積氯仿,混合均勻后25℃放置15 min,12 000 rpm離心5 min取上清,加入1/2 Trizol體積異丙醇,混合均勻后25℃放置15 min,12 000 rpm離心 5 min取沉淀,加入Trizol等體積的75%乙醇,8 000 rpm離心5 min后獲得RNA沉淀,并將其溶解于ddH20。全波長分光光度計測定A260/A280。所得mRNA送北京百邁客生物科技有限公司測序、分析。

1.5 轉錄組學分析流程

IIIumina高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序。測序所得raw data通過過濾低質量、接頭污染、N堿基>5%的數據獲得Clean Data。HISAT2軟件獲取reads在參考基因組上的定位信息。StringTie軟件對比對上的reads進行組裝,挖掘新基因。BLAST軟件對新基因信息進行比對,KOBAS 2.0預測氨基酸序列,HMMER軟件對新基因進行注釋(孫濤等, 2021)。FPKM方法計算基因表達量,FPKM=109C/NL。以Fold Change≥2且FDR<0.01為標準,篩選差異基因,所得差異基因進行Gene Ontology功能注釋和KEGG通路富集分析(李媛媛和趙金紅, 2021)。

1.6 Real Time-PCR驗證轉錄組結果

分別選取GST8、ACHE、aminopeptidase、chymotrypsin和β-actin基因,依據基因序列,使用Primer Premier 5設計引物。以1.4所獲得mRNA,進行逆轉錄,qRT-PCR驗證轉錄組結果,以β-actin作為內參基因計算相對表達量,使用對照組表達值進行歸一化處理。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 實驗所用引物

1.7 TEM觀察Vip3Aa對美洲大蠊中腸超微結構的影響

手術剪分離1.3所得中腸組織,樣品大小為1 mm×3 mm×3 mm。2.5%戊二醛固定2 h。0.1 M PBS沖洗3次(15 min/次)。置入1%餓酸固定液約3 h。0.1 M PBS沖洗3次(15 min/次)。組織依次經過50%乙醇(15 min)、70%乙醇(15 min)、90%乙醇(15 min)、90%乙醇:90%丙酮(1∶1)(15 min)、90%丙酮(15 min)、100%丙酮(15 min)、100%丙酮(15 min)、100%丙酮(15 min)4℃脫水。常規滲透、包埋、聚合。超薄切片機(瑞典LKB-1)超薄切片,厚度50～60 nm,3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。HT7700透射電鏡(日本日立公司)80 KV下觀察。

1.8 Hoechst染色觀察Vip3Aa對美洲大蠊中腸細胞凋亡的影響

手術剪分離1.3所得中腸組織,常規冷凍切片,切片厚度5 μm。PBS浸泡去除OCT包埋劑,切片滴加0.5 mL Hoechst 33258,輕微震蕩孵育5 min。使用移液器小心吸去Hoechst 33258,PBS溶液洗兩遍,每次3 min。封片,熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果和分析

2.1 測序數據和質量評估

6個樣本的原始Reads,經過過濾共獲得44.60 Gb Clean Data,單個樣品Clean Data為7.17～8.15 Gb,G+C含量為42.78%～45.23%,Q30堿基比例為93.32%～94.29%(表2)。

表2 本研究測序數據結果統計

2.2 新基因挖掘

分別通過同源蛋白簇分析數據庫(Clusters of Orthologous Groups of proteins,COG)、基因本體數據庫(Gene Ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書數據庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)、Pfam數據庫、Swiss-Prot數據庫、基因非監督直系同源基因組數據庫(Evolutionary Genealogy of Genes: Non-supervised Orthologous Groups Database, eggNOG)和非冗余蛋白序列數據庫(Non-RedundantProtein Sequence, Nr)數據庫注釋,共獲得23 470條美洲大蠊基因,300<=length<1 000基因9 908個,length>=1 000基因12 519。發掘新基因5 757個,其中4 027個得到功能注釋(表3)。

表3 新基因功能注釋結果統計

2.3 美洲大蠊取食Vip3Aa蛋白中腸差異表達分析

Fold Change≥2、FDR<0.01為截斷值,以取食PBS溶液為對照組,取食Vip3Aa蛋白后共篩選到2 302個差異基因,其中1 539個上調,763個下調(圖1)。

圖1 差異基因火山圖

2.4 差異表達基因GO功能注釋和KEGG富集分析

2.4.1差異表達基因GO功能注釋

對2 302個差異基因進行GO基因功能注釋,由GO富集顯示得到生物學功能條目2 218個(P<0.05),其中,生物過程(Biological process,BP)為1 313條,細胞組成(Cellular component,CC)為303條,分子功能(Molecular function,MF)為602條。富集程度最高的前5條生物過程為代謝過程(Metabolic process)、細胞過程(Cellular process)、單生物過程(Single-organism process)、生物調節(Biological regulation)、定位(Localization);富集程度最高的前5條細胞組成為膜(Membrane)、細胞(Cell)、細胞部分(Cell part)、膜部分(Membrane part)、細胞器(Organelle);富集程度最高的前5條分子功能為催化活性(Catalytic activity)、結合(Binding)、轉運活性(Transporter activity)、結構分子活性(Structural molecule activity)、信號轉導活性(Signal transducer activity)(見圖2)。

圖2 差異表達基因GO注釋分類

2.4.2差異表達基因KEGG通路富集分析

KEGG通路富集(P<0.05)結果顯示Vip3Aa活性主要涉及調控溶酶體(Lysosme)、其他多糖降解(Other glycan degradation)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycan degradation)、昆蟲激素合成(insect hormone biosythesis)、鞘糖脂生物合成(Glycospinggolipid biosynthesis)、藥物代謝(Drug metabolism)、凋亡(Apoptosis)等信號通路(圖3)。

圖3 差異表達基因KEGG通路富集分析

2.4 部分基因的qRT-PCR驗證

分別選取GST8、ACHE、aminopeptidase和chymotrypsin基因進行qRT-PCR驗證,以β-actin為內參基因。取食Vip3Aa后,GST8、ACHE、aminopeptidase和chymotrypsin基因均顯著上調(t=3.15,P<0.01;t=4.95,P<0.01;t=2.21,P<0.05;t=2.48,P<0.05),與轉錄組測序結果基本一致(圖4)。

圖4 qRT-PCR 檢測GST8、ACHE、aminopeptidase和chymotrypsin基因

2.5 Vip3Aa對中腸溶酶體和凋亡的影響

2.5.1Vip3Aa對中腸凋亡和溶酶體相關基因影響

檢索溶酶體和凋亡相關基因比較結果:溶酶體相關差異表達基因50個,其中有42個上調,8個下調。凋亡相關差異表達基因21個,其中有17個上調,4個下調(表4,表5)。

表4 部分溶酶體基因轉錄組測序差異倍數

表5 部分凋亡轉錄組基因測序差異倍數

2.5.2透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope, TEM)觀察Vip3Aa對美洲大蠊中腸超微結構的影響

對照組無可見溶酶體,線粒體線粒體呈橢球形,結構完整,輪廓清晰(藍色箭頭)。Vip3Aa處理后,線粒體腫脹、空泡、破裂,出現大量次級溶酶體(紅色箭頭),提示Vip3Aa可以導致中腸上皮細胞結構的損傷,激活溶酶體(圖5)。

圖5 Vip3Aa對美洲大蠊中腸超微結構的影響

2.5.3Hoechst 33342染色檢測Vip3Aa對中腸上皮細胞凋亡的影響

正常中腸上皮細胞的細胞核呈現均勻藍色熒光,Vip3Aa處理后,可見部分細胞的細胞核凝集、固縮、熒光強度增加(紅色箭頭標注),表現凋亡特征(圖6)。

圖6 Vip3Aa給藥后對中腸上皮細胞凋亡的影響

3 結論和討論

美洲大蠊是“四害”之一,也是最常見的家居害蟲。美洲大蠊生活環境惡劣,可攜帶大量病原菌,其可通過爬行和取食等方式機械傳播病菌(Salgado, 2021)。化學殺蟲劑的長期使用,導致了美洲大蠊的耐藥性、再猖獗,殺蟲劑的殘毒也對人類的身體安全造成一定損害,應限制化學殺蟲劑的使用(Rahimianetal., 2019)。生物防治以其安全、高選擇性、環境友好等優點,被認為是一種有潛力的防治方法,如黑胸大蠊Periplanetafuliginosa濃核病毒即被研發用于美洲大蠊的防治(Hanetal., 2013)。

本課題組前期研究發現蘇云金桿菌產生的Vip3Aa蛋白具殺美洲大蠊作用,但其作用機制不明(Liuetal., 2020)。Vip3Aa蛋白主要損傷中腸,因此本文選取中腸進行了轉錄組分析。中腸是產生各類消化酶的主要部位,因此分別選取了4個消化酶基因進行qRT-PCR驗證,證明所得轉錄組數據結果可靠。Vip3Aa蛋白處理后,共獲得了2 302個差異DEGS,其中上調基因1 539個,下調基因763個。為揭示Vip3Aa蛋白殺美洲大蠊作用的分子生理機制,本研究對篩選到的差異基因進行了功能富集。Vip3Aa活性主要涉及調控溶酶體、其他多糖降解、淀粉和蔗糖代謝、糖胺聚糖降解、昆蟲激素合成、鞘糖脂生物合成、藥物代謝、凋亡等信號通路。溶酶體是一種膜性細胞器,通過多種途徑介導細胞凋亡,溶酶體-線粒體途徑中Cathepsins直接或間接導致線粒體通透性改變, 使線粒體促凋亡因子進入細胞質,最終誘導細胞死亡(Nagata, 2018)。

溶酶體誘導的凋亡是多種殺蟲劑的作用機理,如Ningshen等(2017)將殺蟲晶體蛋白(Crystal, Cry)蛋白注射入飛楊阿夜蛾Achaeajanata幼蟲腹腔后,可見溶酶體激活引起組織溶解。印楝素可誘導溶酶體釋放組織蛋白酶,引起中腸細胞凋亡,抑制橘小實蠅Bactroceradorsalis幼蟲的生長(Zhaoetal., 2019)。本研究差異基因中包含溶酶體相關差異基因50個,凋亡相關差異基因21個,因此推測溶酶體可能參與Vip3Aa誘導的美洲大蠊中腸細胞凋亡。后續研究中分別采用透射電鏡和Hoechst 33342染色觀察了中腸組織變化。Vip3Aa處理后,可見大量次級溶酶體出現,部分線粒體腫脹破裂,細胞內出現凋亡形態改變,進一步證實,Vip3Aa蛋白可能通過上皮細胞溶酶體-線粒體損傷介導凋亡通路的激活發揮殺美洲大蠊作用。

綜上所述,本研究通過轉錄組測序了比較Vip3Aa蛋白處理中腸的基因表達差異,并通過差異基因功能富集和病理學觀察初步證實Vip3Aa蛋白可能通過上皮細胞溶酶體-線粒體損傷介導凋亡通路的激活發揮殺美洲大蠊作用,本研究有助于深入了解Vip3Aa蛋白的殺美洲大蠊作用,為將Vip3Aa蛋白用于美洲大蠊的生物防治提供理論依據。下一步的研究中,我們將在細胞水平和動物水平就Vip3Aa激活溶酶體的機制進行深入研究。