球孢白僵菌對象蟲金小蜂安全性評價和亞致死效應研究

喻 芳,張 越,楊佳鵬,楊 洪*,張曉敏,胡大鳴,王 燕

(1. 貴州大學昆蟲研究所,貴州山地農業病蟲害重點實驗室,貴陽 550025;2. 貴州中煙工業有限責任公司,貴陽 550025)

煙草甲Lasiodermaserricorne(Fabricius)隸屬鞘翅目Coleoptera竊蠢科Anobiidae,是世界性倉儲害蟲,分布較廣,其幼蟲取食儲藏期煙葉,不僅會導致煙葉數量損失,還會有蟲尸及蟲糞的殘留導致卷煙變質(李朝輝等,2021)。多年來我國防治煙草甲基本以熏蒸為主,但長期使用導致煙草甲對化學熏蒸藥劑產生抗藥性、防治效果逐漸減弱(張曉敏等,2015)。面對化學農藥使用的弊端,研究者開始利用病原真菌和天敵昆蟲對貯煙害蟲進行生物防治。

象蟲金小蜂Anisopteromaluscalandrae(Howard),屬膜翅目金小蜂科(孫永超等,2007),是體外單寄生蜂,國內外研究表明象蟲金小蜂對煙草甲的防控潛力前景可觀(Ghimireetal.,2007;郭軍等,2018;郭建華等,2021)。此外,國內外研究者還利用微生物對煙草甲的防治進行了研究,如利用綠僵菌Metarhizium、白僵菌Beauveria、蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis等防治煙草甲(高家合等,2005;王慧等,2013;Saeedetal.,2017;田野等,2021)。球孢白僵菌Beauveriabassiana孢子吸附在害蟲體表后萌發菌絲穿透昆蟲體壁在寄主體內繁殖,從而對害蟲造成機械損傷,同時釋放毒素進行侵染致使寄主死亡(Fengetal.,1994;曹慶杰等,2015,Duanetal.,2017;闕生全等,2019),具有對環境無污染,侵染范圍廣、致病性強、適應性強等特點。已有研究報道球孢白僵菌對煙草甲具有良好的防治效果,如朱元等人(2009)研究發現在25℃溫度條件下,球孢白僵菌Bb050722菌株對煙草甲2齡幼蟲的毒力較強;劉愛英等人(2009)利用白僵菌GUIFR-GL-5菌株防治煙草粉螟和煙草甲均有良好防效。

相比單一生物防治措施,多種天敵聯合應用能提高其相互協同防治害蟲的效果(胡中成等,2007;Ikegawaetal.,2015)。吳圣勇等人(2019)的研究表明昆蟲病原真菌與捕食螨二者聯合防治害蟲具有潛在增效作用;楊芷等人(2020)證明球孢白僵菌BbOFDH1-5菌株與赤眼蜂Trichogramma協同防治亞洲玉米螟OstriniafurnacalisGuenée效果比單獨使用赤眼蜂防治的效果更好;錢逸彬等人(2021)研究表明利用煙蚜繭蜂Aphidiusgifuensis攜帶球孢白僵菌Bb81菌株對桃蚜防效高于單獨使用煙蚜繭蜂的防效。因此,在生物防治中,昆蟲病原真菌和天敵昆蟲對害蟲均具有較好的防控潛力,但采用二者同時防治倉儲害蟲時,為有效進行倉儲害蟲生物防治,需明確昆蟲病原真菌對天敵昆蟲的安全性。為此,本研究開展了球孢白僵菌對煙草甲與象蟲金小蜂的致病性研究以及亞致死濃度球孢白僵菌脅迫對象蟲金小蜂F1代生長發育和繁殖的影響,為可持續防控煙倉害蟲提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蟲源:象蟲金小蜂、煙草甲于2016年10月采自貴州中煙公司煙倉(貴陽),在貴州大學昆蟲研究所室內飼養至今,象蟲金小蜂用煙草甲幼蟲飼養,煙草甲用人工飼料(玉米渣∶酵母粉∶煙葉粉=15∶10∶7.5)飼養。飼養條件:溫度: 25±1℃、RH 70%±5%、光周期16 L∶8 D。

供試菌株:貴州大學生命科學學院鄒曉教授贈送的GZUIFRAS1號球孢白僵菌。

1.2 試驗方法

1.2.1球孢白僵菌對煙草甲致病力的測定

參照鄧竣丹等人(2021)研究方法,將攜帶球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株孢子的培養基用20 mL無菌水和10 μL 0.05%吐溫-80混合搖勻,使菌株孢子充分脫落于水中,用紗網濾去殘渣,并用血球計數板在生物顯微鏡下計數后,再進行稀釋定容,配制濃度分別為1×106、1×107、1×108和1×109孢子/mL的球孢白僵菌懸浮液備用。然后采用浸漬法(鄧竣丹等,2021)處理,即將煙草甲高齡幼蟲和初羽化成蟲分別在不同濃度懸浮液中浸沾10 s,并迅速取出,置于放有濾紙的培養皿中,以飼料飼喂,接菌后24 h內用濕棉花團保持RH 85%以上;以0.05%吐溫-80的無菌水處理作對照。將處理的幼蟲和成蟲分別置于25±1℃人工氣候箱中。每個處理浸漬50頭煙草甲幼蟲和成蟲,且每組重復3次。逐日記錄8 d內煙草甲成蟲、幼蟲死亡數,計算死亡率、校正死亡率、致死中時LT50和致死中濃度LC50;之后將死亡的煙草甲幼蟲和成蟲置于25℃下RH 85%以上的培養皿中3 d后,逐日鏡檢死亡幼蟲受感染情況,計算侵染率。

1.2.2球孢白僵菌對象蟲金小蜂致病力的測定

方法同1.2.1,選取羽化第2天的象蟲金小蜂成蟲放入配制好的不同濃度球孢白僵菌懸浮液中浸漬10 s取出放于墊有濾紙的培養皿中,用10%蜂蜜水喂養,接菌后24 h內用濕棉花團保持RH 85%以上,以含有0.05%吐溫-80的無菌水作對照。每個處理30頭象蟲金小蜂成蟲,每組重復3次,每24 h記錄象蟲金小蜂死亡情況,計算死亡率、校正死亡率、致死中時LT50和致死中濃度LC50。之后將死亡的象蟲金小蜂置于25℃下RH85%以上的培養皿中3 d,逐日鏡檢死亡受感染情況,計算侵染率。

1.2.3亞致死濃度球孢白僵菌對象蟲金小蜂F0代存活率的影響

參照楊洪等(2013)研究方法略有改進。為了評估已感染球孢白僵菌的象蟲金小蜂成蟲產卵量的影響,通過球孢白僵菌對象蟲金小蜂的毒力方程計算出其亞致死濃度。先將攜帶白僵菌孢子的培養基至于錐形瓶中,加入20 mL無菌水和 10 μL 0.05%吐溫-80混合搖勻使其基本脫落后,用紗網濾去殘渣,在生物顯微鏡下計數后,再進行稀釋定容,配制成1×109孢子/mL的母液。然后取部分母液用去離子水等比稀釋菌株為LC10和LC25的2個濃度梯度。再分別用亞致死濃度LC10和LC25的GZUIFRAS1號菌株孢子懸浮液浸漬羽化第2天的象蟲金小蜂成蟲,每組15對象蟲金小蜂,以未接菌的象蟲金小蜂成蟲作對照。將處理后的象蟲金小蜂置于大培養皿中,觀察8 d,計算其存活率。

1.2.4亞致死濃度球孢白僵菌對象蟲金小蜂F1代生長發育和繁殖力的影響

以LC10和LC25濃度的菌株孢子懸浮液處理象蟲金小蜂成蟲(已交配過的雌蜂)后,將其分別置于裝有150粒包含煙草甲幼蟲的繭的大培養皿中,寄生8 h后,分別取出50粒卵(連帶寄主),將其單個放入小培養皿中置于人工氣候箱內飼養。以未接菌的象蟲金小蜂成蟲作對照。每處理取50粒卵單頭飼養,每24 h觀察一次,并記錄F1代幼蟲發育歷期、存活率和雌性比。

將每組處理正常羽化出的F1代雌雄蜂進行配對,置于培養皿中單對飼養,每對蜂每2 d接入30粒/皿內含有煙草甲老熟幼蟲繭供其產卵寄生。以未接菌的F1代象蟲金小蜂成蟲作對照。從接蜂之日開始,每處理分別共記錄50頭象蟲金小蜂雌蜂產卵量,直至象蟲金小蜂死亡。

1.2.5象蟲金小蜂室內種群生殖力生命表的構建

參照楊洪等(2013)方法組建象蟲金小蜂的種群生命表。根據昆蟲特征年齡(x)、特征存活率(lx)和產卵量(mx)等參數,以d(x)為單位間隔,組建亞致死濃度球孢白僵菌對象蟲金小蜂F1代的種群生命表,生命表參數計算公式如下:

凈增殖率R0=∑lxmx;

平均世代周期T=∑xlxmx/R0;

內稟增長率rm=ln(R0)/T;

周限增長率λ=erm;

種群倍增時間Dt=ln(2)/rm。

其中x為以2 d為單位的時間間隔;lx為個體在x期間的存活率;mx為在x期間內單雌產卵量。

1.3 數據分析

數據采用Excel 2016整理,生存曲線圖采用Graphpad Prism 8軟件繪制,并利用Log-rank test進行組間差異顯著性檢驗。采用DPS數據處理系統軟件進行毒力測定,并計算致死中時LT50和致死中濃度LC50,同時,文中產卵量、產卵前期、壽命、存活率、侵染率等指標采用單因素方差分析后,再利用LSD法多重比較。計算方式如下:

死亡率(%)=死亡蟲數/供試蟲數×100

存活率(%)=1-死亡率=存活蟲數/供試蟲數×100

校正死亡率(%)=(處理組的死亡率-對照組的死亡率)/(1-對照組的死亡率)×100

侵染率(%)=侵染死亡蟲數/供試蟲數×100

雌性比=雌蜂數/總出蜂數

2 結果與分析

2.1 球孢白僵菌對煙草甲致病力的測定

致病力測定結果表明,球孢白僵菌不同濃度對煙草甲幼蟲致病力均較高(表1),球孢白僵菌濃度為1×109孢子/mL和1×108孢子/mL對煙草甲幼蟲的致死時間最短,分別為3.35 d和3.33 d,校正死亡率均在90%以上,二者之間差異不顯著(P>0.05)。濃度1×107孢子/mL對煙草甲校正死亡率為89.74%,LT50為4.58 d。濃度1×106孢子/mL對煙草甲校正死亡率為63%,LT50為7.38 d,與其他3個濃度均表現差異性顯著(P<0.05)。因此,在同等條件下,1×106孢子/mL濃度以上的球孢白僵菌對煙草甲幼蟲均呈現高毒力,計算其3 d的致死中濃度為3.556×106孢子/mL。

表1 不同濃度球孢白僵菌對煙草甲幼蟲的致病力

球孢白僵菌不同濃度孢子對煙草甲成蟲均具有較高致病力(表2),其中,球孢白僵菌濃度為1×109孢子/mL和1×108孢子/mL對煙草甲成蟲的校正死亡率為100.00%和99.26%,致病時間最快,均約為2 d,二者之間差異不顯著(P>0.05)。濃度為1×107孢子/mL時,對煙草甲成蟲的校正死亡率為97.04%,LT50為3.33 d。濃度為1×106孢子/mL時,對煙草甲成蟲的校正死亡率為95.56%,LT50為3.96 d,與其他3個濃度均表現差異性顯著(P<0.05),計算其3 d的致死中濃度為2.629×106孢子/mL。

表2 不同濃度球孢白僵菌對煙草甲成蟲的致病力

不同濃度孢白僵菌對煙草甲幼蟲和成蟲的生存曲線影響較大(圖1),與對照組相比,不同濃度球孢白僵菌對煙草甲幼蟲和成蟲致病力較高,且其死亡率和死亡速率均呈正相關,且球孢白僵菌濃度從1×106孢子/mL至1×109孢子/mL均有顯著性差異(P<0.0001),且每個濃度的球孢白僵菌對煙草甲幼蟲和成蟲的存活率均低于10%。從以下兩個圖對比可看出,球孢白僵菌對煙草甲成蟲的致死率高。

圖1 不同濃度球孢白僵菌侵染煙草甲幼蟲和成蟲后的生存曲線圖

2.2 球孢白僵菌對象蟲金小蜂成蟲致病力的測定

球孢白僵菌對象蟲金小蜂成蟲的致病力影響(表3),1×107孢子/mL以上的球孢白僵菌濃度對象蟲金小蜂成蟲均具有較高致病力,死亡率在67.09%～100%之間。其中,球孢白僵菌濃度為1×109孢子/mL和1×108孢子/mL時對象蟲金小蜂成蟲的校正死亡率為100.00%和98.73%,LT50為3.15 d和2.78 d,二者之間差異不顯著(P>0.05)。濃度10×106孢子/mL對象蟲金小蜂成蟲校正死亡率為67.90%,LT50為5.21 d。濃度1×106孢子/mL對象蟲金小蜂成蟲校正死亡率為35.45%,LT50為8.33 d,與其他3個濃度均表現差異性顯著(P<0.05),計算其3 d的致死中濃度為2.725×106孢子/mL。

表3 不同濃度球孢白僵菌對象蟲金小蜂成蟲的致病力

不同濃度球孢白僵菌對象蟲金小蜂成蟲致病力較高,且對象蟲金小蜂成蟲的死亡率和死亡速率與對照組對比,均呈正相關(圖2)。其中,球孢白僵菌濃度為1×106孢子/mL至濃度1×109孢子/mL與對照組相比均有極顯著性差異(P<0.0001),當濃度為1×108孢子/mL和1×109孢子/mL時,象蟲金小蜂成蟲的存活率均低于10%。

圖2 不同濃度球孢白僵菌侵染象蟲金小蜂成蟲后的生存曲線

2.3 球孢白僵菌對象蟲金小蜂成蟲的毒力測定

采用浸漬法測定了球孢白僵菌對象蟲金小蜂的致病力(表4)。球孢白僵菌對象蟲金小蜂成蟲的毒力回歸方程為y=1.157x+3.340,斜率為1.157,相關系數為0.985。亞致死濃度LC10和LC25分別為2.125×105孢子/mL和7.114×105孢子/mL。

表4 球孢白僵菌對象蟲金小蜂成蟲的毒力

2.4 亞致死濃度球孢白僵菌對F0代象蟲金小蜂存活率的影響

亞致死濃度球孢白僵菌處理對F0代象蟲金小蜂生存曲線有較大影響(圖3),經LC10和LC25處理后,象蟲金小蜂的存活率均低于對照。由此可看出,球孢白僵菌對象蟲金小蜂具有很強的致病力。

圖3 亞致死濃度球孢白僵菌脅迫對F0代象蟲金小蜂存活率的影響

2.5 亞致死濃度球孢白僵菌對F1代象蟲金小蜂生長發育的影響

球孢白僵菌亞致死濃度處理對象蟲金小蜂F1代發育歷期有一定影響(表5),與對照組相比,LC10處理和LC25處理后的象蟲金小蜂F1代卵期略縮短,總歷期分別延長0.73 d和0.75 d,均表現顯著差異(P<0.05)。象蟲金小蜂幼蟲期和蛹期與對照相比略延長,差異不顯著(P>0.05)。其中,LC25處理的象蟲金小蜂卵期和成蟲前期比LC10處理的長,分別為0.13 d和0.02 d,但均無顯著差異(P>0.05)。說明該菌株對象蟲金小蜂的發育速率有一定的抑制作用。

表5 亞致死濃度球孢白僵菌脅迫對 F1 代象蟲金小蜂生長發育的影響

2.6 亞致死濃度球孢白僵菌對F1代象蟲金小蜂繁殖力及壽命的影響

球孢白僵菌脅迫處理對F1代象蟲金小蜂代繁殖力及成蟲壽命的影響較大,受菌株處理前后象蟲金小蜂產卵期、產卵量、雌性比及成蟲壽命都發生了一定的變化(表6)。對照組象蟲金小蜂產卵期和產卵量分別為20.14 d和114.25粒,與對照相比,經LC10和LC25處理后,雌成蟲的產卵期縮短(分別為19.33 d和16.5 d),產卵量降低(分別為92.42粒和74.86粒),這表明球孢白僵菌對對雌成蟲產卵量有很強的抑制作用。但三組處理之間雌性比表現無顯著性差異(P>0.05)。與對照相比,在LC10處理后,成蟲壽命差異不顯著(P>0.05);LC25處理后,成蟲壽命差異顯著(P<0.05)。綜上,隨著球孢白僵菌濃度升高,對象蟲金小蜂F1代成蟲繁殖力及其壽命影響越大,且能在一定程度抑制象蟲金小蜂的繁殖力。

表6 亞致死濃度球孢白僵菌脅迫對F1代象蟲金小蜂成蟲繁殖力和壽命的影響

球孢白僵菌處理對象蟲金小蜂F1代的平均日產卵量有一定影響,對照組與處理組的平均日產卵量曲線均呈多峰型,對照組產卵最高峰期在成蟲羽化后12 d (圖4),LC10和LC25處理產卵最高峰期分別是28 d和20 d;處理組的平均日產卵量曲線基本處于對照組的下方,說明,該菌株對象蟲金小蜂的產卵量具有一定的抑制作用。

圖4 球孢白僵菌脅迫對F1代象蟲金小蜂平均日產卵量的影響

2.7 亞致死濃度球孢白僵菌對F1代象蟲金小蜂存活率的影響

亞致死濃度球孢白僵菌處理對F1代象蟲金小蜂存活曲線,處理組的存活率明顯低于對照。第1～2 d,處理組的存活率基本與對照相同,之后開始下降;處理組的存活時間也明顯短于對照(圖5)。

圖5 亞致死濃度球孢白僵菌脅迫對F1代象蟲金小蜂存活率的影響

2.8 亞致死濃度球孢白僵菌對F1代象蟲金小蜂生命表參數的影響

根據象蟲金小蜂F1代各發育階段的存活率和成蟲的繁殖力,組建了不同亞致死球孢白僵菌濃度處理后象蟲金小蜂F1代的生殖力生命表(表7～9),并得出不同處理后的種群生命表參數(表10)。從反映種群動態較為敏感的參數rm值來看,經亞致死濃度球孢白僵菌LC10和LC25脅迫處理后,與對照相比,隨濃度增加,象蟲金小蜂的凈增殖率R0由35.5200下降至14.1552,平均世代周期T相差不大,種群倍增時間Dt也隨之增加,由7.1311 d升至9.1808 d。LC10處理下的平均世代周期T、種群倍增時間Dt、種群內稟增長率rm和周限增長率λ均與對照組相差不大。以上種群參數表明,隨著球孢白僵菌處理的濃度越高,象蟲金小蜂種群生殖力呈下降趨勢,一定程度上抑制了種群增長的速率,但LC10處理后的結果基本與對照組相當,對象蟲金小蜂種群增長速率影響較小。

表7 對照處理組象蟲金小蜂實驗種群生殖力生命表

表8 LC10球孢白僵菌脅迫下象蟲金小蜂實驗種群生殖力生命表

表9 LC25球孢白僵菌脅迫象蟲金小蜂實驗種群生殖力生命表

表10 亞致死濃度球孢白僵菌脅迫對F1代象蟲金小蜂的生命表參數的影響

3 結論與討論

球孢白僵菌對大多數害蟲都有較強致病力,它是一種潛在的環境友好型生物殺蟲劑(Duanetal.,2017)。在防治害蟲時采取以球孢白僵菌與其他藥劑或天敵聯合防治害蟲能有效提高防效,目前多數研究是以球孢白僵菌和各藥劑聯合防治害蟲(陳翰秋,2018;曹偉平等,2018;關朝陽等,2022),也有研究以球孢白僵菌與天敵昆蟲或螨聯合防治害蟲(劉洪劍等,2007;鄧竣丹等,2021;錢逸彬,2021)。

本研究表明,球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株對煙草甲和象蟲金小蜂均表現較強致病力,且死亡率和死亡速度隨著濃度增加而顯著增加(P<0.05),當菌株孢子濃度為1×108孢子/mL和1×109孢子/mL處理時,煙草甲和象蟲金小蜂存活率均低于10%,此研究結果與劉玉軍等(2008)研究的高毒力球孢白僵菌(Bb202菌株)對櫟旋木柄天牛Aphrodisiumsauteri的致死效果一致。同時,在本研究中發現球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株對象蟲金小蜂也有較強致病力,此結果與鄧竣丹等(2021)研究利用天敵昆蟲花絨寄甲Dastarcushelopho-roides與球孢白僵菌(Bb3275菌株、Bb202菌株)聯合防治具有相容性不同,且與錢逸彬(2021)研究煙蚜繭蜂的攜帶球孢白僵菌Bb81防治煙蚜具有協同增效的結果也不同。推測一可能是供試球孢白僵菌菌株不同造成;二可能是試驗方法不同造成。本研究采取浸漬法,此法會讓象蟲金小蜂全身都沾到菌株孢子,孢子通過象蟲金小蜂體壁進入,并繁殖,使其致病;而采取涂膜攜帶菌株孢子的方法基本只會沾到具有一定絨毛的足部和觸角,從而使其不容易被感染。因此,象蟲金小蜂與球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株不能兼容的結果可能受多方面因素影響,這對后續深入研究二者混用具有重要意義。

為進一步探討球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株對象蟲金小蜂的安全性,本研究采用球孢白僵菌亞致死濃度LC10和LC25脅迫處理象蟲金小蜂成蟲,發現其F0代和F1代的存活率均顯著低于對照(P<0.05),且F1代雌成蟲產卵量和成蟲壽命與對照相比均降低,發育歷期比對照均有延長,象蟲金小蜂內稟增長率rm、凈增值率R0和周限增長率λ均隨著濃度增加而減小,而種群倍增時間Dt延長。這說明球孢白僵菌亞致死濃度能夠抑制象蟲金小蜂種群的增長速率,這與張興瑞研究表明的球孢白僵菌對劍毛帕厲螨具有的間接影響結果相似(張興瑞,2019)。

通過本研究結果可看出,球孢白僵菌GZUIFRAS1菌株對煙草甲和象蟲金小蜂的致病力較強,并會加快其死亡速率。球孢白僵菌亞致死濃度LC10和LC25處理對象蟲金小蜂F1代產卵期、產卵量和成蟲壽命均有不同程度的影響,且球孢白僵菌可抑制象蟲金小蜂種群繁殖力的增長,因此,采用白僵菌和象蟲金小蜂防治煙草甲時,可考慮錯峰防治或采用不同釋放方式進行防治。