20E誘導家蠶抗菌肽CecropinB6的上調表達

王禹生,田小利,肖 陽,張 杰,梁 寬,黃浩賢,鄧小娟*

(1. 華南農業大學動物科學學院/廣東省農業動物功能基因組學與分子育種重點實驗室/廣東省蠶桑工程技術研究中心,廣州 510642;2. 廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所,廣州 510610)

昆蟲具有極強的適應性,是地球上種類最多、分布最廣的類群,這主要是因為它們具有強大的先天免疫系統。當微生物突破昆蟲的第一道防線——物理屏障時,被宿主模式識別受體(PRR)識別并激活宿主的先天免疫(Luetal., 2020)。先天免疫系統由細胞免疫和體液免疫兩部分組成,細胞免疫由血細胞執行的吞噬、包囊和凝結等組成,而體液免疫包括黑化作用、合成和分泌抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)與溶菌酶等(Lemaitre &Hoffmann, 2007;Yangetal., 2021)。細胞免疫和體液免疫發揮各自不同的作用,并協同工作以清除外來的病原物(Haineetal., 2008)。AMPs是一類重要的抗菌效應分子,受病原誘導并能在昆蟲持續存在達數周之久(Makarovaetal., 2016)。微生物誘導AMPs的產生主要通過進化保守的Toll、IMD和JAK/Stat等信號通路進行調控(Yangetal., 2021),1990s Toll受體在果蠅Drosophilamelanogaster中激活抗感染免疫功能的闡明(Lemaitreetal.,1996)促進了哺乳動物Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)的發現,并極大地推動了先天免疫分子機制的研究(Vijay, 2018)。

除了病原微生物的感染,AMPs的表達也受到非感染因素的誘導,如營養剝奪(Uncklessetal., 2015)、激素(Reynoldsetal., 2020)和DNA損傷(Karpacetal., 2011)等。饑餓信號能降低果蠅ILS水平激活絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt,進而導致轉錄因子FoxO被激活進入細胞核內,啟動AMPs基因的表達(Beckeretal., 2010; Zhangetal., 2018)。類固醇激素20-羥基蛻皮酮(20E)作為昆蟲發育和變態的重要調節因子,也調控AMPs基因的表達(Flatetal., 2008; Hanetal., 2017),現有的研究表明20E可以通過調控肽聚糖識別蛋白(PGRP)進而調節AMPs的表達(Rusetal., 2013; Wangetal., 2014; Hanetal., 2017),也可以通過20E信號通路中關鍵因子BR-C調控AMPs的表達(Maietal., 2017)。

隨著家蠶基因組計劃的完成,在家蠶基因組中發現和鑒定了Attacins、Cecropins、Moricins, Gloverins、Enbocins、Lebocins和Defensins 7個AMPs家族的37條基因序列,部分序列的抗菌功能得到鑒定(Chengetal., 2006; Yangetal., 2011)?；诳咕V、抗菌活性和微生物對AMPs基因的轉錄誘導活性,推測BmCecB6、BmcecD和Bmmor在清除微生物感染的免疫過程中起重要作用(Yangetal., 2011)。20E對家蠶AMPs表達的影響及其分子機制的研究較少,Tian等(2010)發現20E抑制家蠶Moricin和Cecropin等AMPs基因的轉錄水平。本研究對20E調控家蠶抗菌肽BmCecB6的表達進行研究,并對BmCecB6的啟動子進行截短和雙熒光素酶啟動子活性分析,以期為進一步揭示昆蟲的發育與免疫之間的聯系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶幼蟲:品種為大造,五齡幼蟲在25℃±1℃以新鮮桑葉飼養。家蠶細胞卵巢細胞系Bm-12用含有10%(v/v)胎牛血清(Gibco)和90%(v/v)TNM-FH培養基(Sigma Aldrich,USA),在27℃恒溫培養箱中培養。

pGL3-Basic螢火蟲熒光素酶質粒載體和pRL-Null海腎熒光素酶質粒載體(美國Promega公司)由華南師范大學昆蟲研究所李勝研究員提供,pRL-Null插入Actin5報告基因構建成pRL-Null-Actin5海腎熒光素酶重組內參質粒用于檢測細胞中的本底熒光值。

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態細胞購自北京天根生物公司。

Phospho-Drosophila Akt (Ser505)和Akt抗體為Cell signaling technology公司產品,Tubulin 單克隆抗體和HRP標記的山羊抗兔及HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自碧云天生物技術研究所。

蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)為美國Sigma Aldrich公司產品。Trizol Reagents總RNA抽提試劑盒,限制性內切酶、反轉錄用試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)、T4 DNA ligase、Primer-STAR DNA聚合酶均購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司。實時熒光定量PCR試劑SsoFast EvaGreen Supermix為美國Bio-Rad產品。Effectene Transfection Reagent轉染試劑盒為德國Qiagen公司產品。Dual-Luciferase Report Assay System試劑盒為Promega公司產品。

1.2 方法

1.2.120E處理方法

20E注射家蠶幼蟲:取家蠶5齡第3天幼蟲,以微量注射器從腹部最后一對足處注射5 μL 20E工作液(相當于5 μg/頭),3、6、9和12 h后收集脂肪體。為了探討不同劑量的20E對AMPs表達的影響,設置0.05、0.5、5和10 μg/頭的處理組,注射6 h后進行樣品收集和預處理,并以注射等體積的20%乙醇為對照。將5頭家蠶的脂肪體作為一個樣品,每個處理取3個重復樣品。

20E處理離體培養的家蠶脂肪體組織:取家蠶5齡第3天幼蟲,以75%酒精進行體表消毒、晾干,用解剖剪剖開體腔后從腹部刮取脂肪體,于無菌的昆蟲生理鹽水中漂洗后轉移至含有Grace昆蟲培養基(Antibiotic-Antimycotic)的6孔板中進行無菌培養。培養3 h后加入20E使終濃度為5 μg/mL,處理4、8和12 h后收集脂肪體備用,以加入等體積的20%酒精處理作為對照。

20E處理Bm-12細胞:在對數生長期的Bm-12細胞中分別加入20E,使終濃度為0.01、0.1、1和10 μg/mL,處理4、8和12 h后收集細胞備用,以加入等體積的20%酒精作為對照。

1.2.2qRT-PCR對AMPs基因的表達定量

為檢測AMPs基因的表達水平,取家蠶五齡幼蟲脂肪體和Bm-12細胞,根據MIQE指南的標準(Bustinetal., 2010)進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)。首先按TRIzol Reagent RNA(Invitrogen)提取試劑使用說明書提取總RNA,總RNA經PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉錄合成cDNA,在CFX96定量PCR儀(Bio-rad)檢測AMPs、胰島素受體InR和20E受體初級轉錄因子E75a的轉錄活性,參考Zhang等(2018)設計定量引物,序列見表1。采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(Bio-rad),反應體系為:SsoFast EvaGreen Supermix (2×)10 μL,引物(10 μmol/L)各0.2 μL,cDNA 0.1 μL(相當于10 ng 總RNA),加ddH2O至總體積20 μL。反應程序為:95℃預變性1 min;(95℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 45 s)循環40次;溶解曲線在65～95℃每隔0.5℃采集1次,每次采集5 s。以rp49(核糖體蛋白,ribosome protein,rp49)作為內參基因,采用2-ΔΔct法(Livak &Schmittgen, 2001)計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3BmCecB6啟動子序列的擴增

取家蠶脂肪體,利用Tissue DNA Kit (OMEGA,USA)抽提基因組DNA,根據家蠶基因組數據庫Silkbase 3.0獲得的BmCecB6啟動子序列,設計擴增不同長度的啟動子序列引物。上游引物序列見表2,下游引物BmCecB6_R:5′-GAAGATCTGTTCACTCGTACACGGCTCAAAC-3′,下劃線序列分別為BglII酶切位點。PCR反應體系:TaKaRa Ex Taq(5 U/μL)0.25 μL,10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5 μL,dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL,上下游引物(20 μmol/L)各1 μL,基因組模板DNA 2.5 ng,加ddH2O補充到50 μL。PCR反應參數為:94℃ 4 min→(94℃ 1 min→58℃ 30 s→72℃ 1.2 min)×30 cycles→72℃ 10 min→4℃ ∞。經瓊脂糖凝膠電泳分析獲得與預期大小相符的條帶,按AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒說明書進行目的條帶的回收與純化。

表2 擴增截短的BmCecB6啟動子引物序列

1.2.4構建BmCecB6不同長度啟動子的pGL3-Basic重組載體

使用限制性內切酶MluI和BglII對pGL3-Basic啟動子載體和BmCecB6啟動子序列(野生型,wt)進行雙酶切,分別回收大片段后于16℃連接過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,經amp篩選和PCR鑒定,將陽性克隆送上海生工生物技術有限公司進行測序確認,構建成功的重組載體命名為pGL3-BmCec6_wt。

1.2.5構建缺失FoxO結合位點的BmCecB6啟動子的pGL3-Basic重組載體

BmCecB6啟動子上游1 623 bp區域存在5個可能的FoxO結合位點(TXTTTAY;X-N,Y-C/T),采用重疊PCR方法按1～5的順序依次進行FoxO結合位點的缺失突變(Zhangetal., 2018),引物序列見表3。由于第2、3、4三個位點緊密相鄰,可將3個位點同時進行缺失突變,經過3輪定點突變后,即可獲得缺失FoxO結合位點的BmCecB6_△FoxO1-5上游序列。按1.2.4的方法將缺失FoxO結合位點的BmCecB6啟動子序列插入pGL3.0-Basic,構建成功的載體命名為pGL3-BmCecB6_△FoxO1-5。

表3 BmCecB6啟動子序列缺失FoxO結合位點的重疊PCR引物序列

1.2.6啟動子活性分析

利用Effectene Transfection Reagent轉染試劑盒分別將重組質粒pGL3-BmCecB6_wt和pGL3-BmCecB6_△FoxO1-5與內參質粒pRL-Null-Actin5共轉染Bm-12細胞,轉染48 h后,用20E(1 μg/mL)處理細胞8 h,室溫1 000 r/min離心10 min收集細胞,棄上清。用0.1 mol/L PBS清洗細胞,收集到的細胞按雙熒光素酶報告檢測試劑盒檢測雙熒光值,計算螢火蟲熒光素酶(Fluc luciferase, Fluc)與海腎熒光素酶(renilla luciferase,Rluc)比值。

1.2.7免疫印跡檢測

用細胞裂解液裂解細胞后提取總蛋白,上樣進行12% SDS-PAGE,然后將蛋白轉移到PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉30 min后,用p-Akt抗體Phospho-Drosophila Akt (Ser505)、總Akt抗體、Tubulin抗體室溫孵育過夜,TBST清洗3次后用二抗室溫孵育2 h,再用TBST清洗3次,最后用ECL化學發光檢測試劑盒進行顯色反應。

1.2.8數據處理

實驗中采用3個獨立的家蠶脂肪體樣本或3個獨立的細胞培養液,每次實驗分析中的每個樣品采用3～5個重復。使用GraphPad Prism 8.0軟件t-檢驗方法對數據進行統計分析,星號表示差異顯著(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)。

2 結果與分析

2.1 20E上調家蠶BmCecB6的表達

20E調控家蠶蛻皮的信號通路中,E75是20E的初級應答基因,E75家族中E75a對20E響應較為明顯(Lietal., 2016)。為測試家蠶對20E的應答,取5齡第3天的幼蟲按5 μg/頭的劑量注射20E,通過qRT-PCR檢測對20E處理后的幼蟲脂肪體中BmE75a基因的轉錄活性,結果如圖1所示。20E注射后,家蠶幼蟲脂肪體中BmE75a在3 h、6 h轉錄活性上調顯著,9 h和12 h轉錄活性降低,與對照沒有顯著差異(圖1-a)。為檢測AMPs基因對20E的應答,本研究檢測了20E處理的AMPs轉錄水平變化,結果表明BmCecB6(BmCecropinB6)在20E誘導6 h有明顯的上調,而家蠶BmdefB(BmDefensinB)和Bmmor(BmMoricin)的表達在20E處理后沒有顯著的變化(圖1-b),因此選擇BmCecB6作為后續檢測應答20E的抗菌肽靶基因。

圖1 注射20 E后家蠶幼蟲脂肪體中 E75a和AMPs的轉錄水平

為了確定20E的最佳處理劑量,本研究測試了每頭幼蟲注射不同劑量的20E對BmE75a和BmCecB6的誘導效果,結果表明低濃度的20E(0.05 μg/頭和0.5 μg/頭)處理后,BmE75a和BmCecB6的轉錄活性均沒有明顯的變化;5 μg/頭20E能顯著上調BmE75a和BmCecB6的表達(見圖2)。高劑量的20E(10 μg/頭)注射后48 h左右,家蠶出現體節發黑、口吐黃色液體的現象,有少部分家蠶死亡?？梢?0 μg/頭的劑量嚴重影響了家蠶的生理和發育。因此,處理5齡幼蟲20E的合適劑量為5 μg/頭。

圖2 注射不同劑量的20E后家蠶幼蟲中脂肪體中E75a和BmCecB6的轉錄水平

20E處理促進家蠶5齡幼蟲脂肪體中的抗菌肽BmCecB6的表達上調,那么20E是否同樣能上調游離培養的脂肪體和Bm-12細胞中BmCecB6基因的表達?qRT-PCR結果顯示20E也能上調離體培養的脂肪體和Bm-12細胞中BmCecB6的轉錄水平(圖3)。

圖3 20E誘導家蠶游離培養的脂肪體和Bm-12細胞中BmCecB6的表達

為探索20E處理Bm-12細胞的最佳處理濃度,本研究設置了4個不同濃度的20E(0.01、0.1、1和10 μg/mL細胞培養液)處理Bm-12細胞,8 h后收集細胞檢測BmCecB6的轉錄表達活性,結果顯示:0.01 μg/mL 20E處理的Bm-12細胞中,BmCecB6

的表達無明顯變化;0.1、1、10 μg/mL的20E均顯著上調BmCecB6的轉錄活性,以1 μg/mL和10 μg/mL誘導的效果最為明顯(圖4)。雖然1 μg/mL與10 μg/mL的20E處理細胞后BmCecB6的表達上調明顯且無明顯差異,但鑒于高濃度的20E對Bm-12細胞正常生長有一定的影響,后續的細胞實驗采用的20E處理濃度為1 μg /mL。與紅頭麗蠅Calliphoravicina脂肪體細胞中報道的結果(Gordyaetal., 2016)不同,Bm-12細胞中沒有出現高濃度20E抑制免疫應答的現象。

圖4 不同濃度的20E處理家蠶Bm-12細胞誘導BmCecB6的轉錄活性

2.2 截短型BmCecB6啟動子活性分析

為探討20E誘導AMPs表達的分子調控機制,使用在線軟件MatInspector (http://www. genomatix.de/products/index.html)對BmCecB6啟動子區進行轉錄因子結合位點的預測分析,發現BmCecB6的1.6 kb啟動子區存在NF-κB、FoxO和EcR、BR-C、E74A等轉錄因子的結合位點(圖5)。根據這些轉錄因子結合位點在啟動子中的位置,將1 623、1 003、630、448和170 bp共5個不同長度的啟動子序列,通過雙熒光素酶活性分析測定不同長度的啟動子對20E的響應情況,結果如圖6所示。圖6顯示-1 003～-1、-630～-1和-448～-1啟動子活性和野生型啟動子無明顯差異,而20E對-170～-1啟動子的誘導轉錄活性明顯下降,說明BmCecB6對20E的應答元件在-448～-170啟動子區域。該區域存在1個NF-κB、3個FoxO、2個BR-C和1個E74A位點。

圖5 BmCecB6啟動子區域潛在轉錄因子結合的預測分析

圖6 不同長度的BmCecB6啟動子活性分析

2.3 FoxO不是直接調控BmCecB6的轉錄因子

BmCecB6在-448～-170啟動子區域存在對20E的可能應答元件NF-κB、FoxO、BR-C和E74A位點,其中NF-κB為昆蟲體液免疫通路(Toll和Imd信號通路)中的關鍵轉錄因子,參與微生物感染誘導的免疫機制(Lemaitre &Hoffmann, 2007);FoxO為類胰島素信號(ILS)中的重要轉錄因子,近年來發現FoxO也參與饑餓誘導的免疫(Beckeretal., 2010; Zhang &Palli, 2018);BR-C和E74A是響應20E信號的初次級轉錄因子,在家蠶中已經證明BR-C調控20E誘導變態發育期中腸抗菌肽lebocin的表達(Maietal., 2017)。為了驗證FoxO是否參與20E誘導的BmCecB6表達調控,首先通過qRT-PCR檢測FoxO的靶標基因胰島素受體(BmInR)的表達是否上調來判斷20E處理后是否激活家蠶轉錄因子FoxO,qRT-PCR結果如圖7所示,顯示20E處理后的家蠶幼蟲脂肪體、離體培養脂肪體和Bm-12細胞中BmInR的表達上調,暗示了20E處理減弱類胰島素信號通路(ILS)水平,激活的轉錄因子FoxO入核調控靶標基因BmInR的表達。對Akt磷酸化水平的檢測結果顯示20E處理導致Akt磷酸化水平下降(圖8),證實了上述的實驗結果。20E處理導致ILS水平下降,FoxO去磷酸化而被激活入核,與Hossain等(2013)報道的結果相符。

圖7 20E處理導致BmInR表達上調

圖8 20E處理導致Bm-12細胞中Akt磷酸化水平降低

為了進一步FoxO的激活是否參與20E誘導的BmCecB6表達調控,將BmCecB6啟動子區(1.6 kb)的FoxO位點利用重疊PCR的方法進行缺失(Deletion)突變后,測序正確后插入pGL3 Basic載體,構建成缺失FoxO位點的pGL3-BmCecB6_△FoxO1-5重組載體。采用雙熒光素酶活性分析缺失FoxO位點對BmCecB6應答20E活性的影響,將pGL3-BmCecB6_△FoxO1-5和野生型啟動子重組載體pGL3-BmCecB6_wt轉染Bm-12細胞,檢測雙熒光素活性,結果顯示缺失FoxO位點對啟動子活性沒有明顯的影響(圖9),可見BmCecB6啟動子對20E的應答活性不是通過FoxO結合到BmCecB6啟動子區的順式元件直接起作用的。

圖9 缺失FoxO結合位點對BmCecB6啟動子活性的影響

3 結論與討論

在昆蟲中,20E與JH協同作用,調節蛻皮、變態和發育繁殖(Riddifordetal., 2003; Zhuetal., 2021)。越來越多的證據表明20E還參與昆蟲先天免疫過程,如吞噬和AMPs的產生(Dimarcqetal., 1997; Flattetal., 2008; Zhang &Palli, 2009; Rusetal., 2013; Nunesetal., 2021)。哺乳動物中的研究也表明類固醇激素及其受體對先天免疫和炎癥反應起著重要的調節作用(Benagianoetal., 2019)。果蠅幼蟲中微生物感染誘導體內產生抗菌肽diptericin,只有在3齡幼蟲后期20E滴度達到足夠的量時才會發生(Meister &Richards, 1996);感染前以20E預處理果蠅S2細胞可以提高AMPs基因的轉錄水平(Flattetal., 2008);本研究也證實了20E的處理可以激活家蠶BmCecB6的表達。Wang等(2014)發現,棉鈴蟲Helicoverpaarmigera在化蛹前的游走期,隨著20E滴度增高,脂肪體中抗菌肽Attacin、Gloverin、Cecropin和溶菌酶Lysozyme等基因的轉錄表達上調。20E激活飛蝗AMPs基因表達的同時,也能激活體液免疫的其他成分,比如酚氧化酶系統(Hanetal., 2017; Hanetal., 2020)。

20E對昆蟲免疫系統的影響,除了調節體液免疫,其滴度升高同時可以激活細胞免疫(Reganetal., 2013)。在岡比亞按蚊Anophelesgambiae(Ahmedetal., 1999;Reynoldsetal., 2020)、昔古比天蠶Hyalophoracecropia(Roxstr?m-Lindquistetal., 2005)、印度谷螟Plodiainterpunctella(Ayeetal., 2008)和煙草天蛾Manducasexta(Zouetal., 2005)等昆蟲中均報道了20E的免疫激活作用。值得注意的是,一方面20E促進昆蟲的免疫反應,提高昆蟲對病原微生物的抵抗能力;另一方面,微生物感染昆蟲后可以通過 3-脫氫蛻皮激素-3β-還原酶(3DE-3β-reductase)促進20E滴度升高,同時促進免疫反應(Sunetal., 2016),表明昆蟲的免疫與20E的激素水平存在相互作用的關系。

20E激活并增強昆蟲的體液免疫作用,是與其生理發育相適應的。在完全變態昆蟲由幼蟲—蛹的變態發育過程中,20E結合到由脫皮激素受體(EcR)和超氣門蛋白(USP)組成的異源二聚體上,并激活包括廣泛復合體(BR-C)和E74在內的初、次級轉錄因子的信號級聯反應(Baehrecke, 2000),最終導致幼蟲組織的降解和蛹組織的再生。新舊組織的替換和更新過程中,昆蟲容易受到微生物的感染,此時體內20E水平的升高激活的免疫反應對變態發育期的蟲體起到重要的保護作用。然后,也有些研究顯示20E具有免疫抑制的作用:Gordya等(2016)發現在紅頭麗蠅脂肪體細胞中,低濃度的蛻皮激素能夠提高其免疫力,誘導AMPs的表達,而高濃度的蛻皮激素會抑制其免疫反應;20E處理可以抑制家蠶某些AMPs基因轉錄水平(Tianetal., 2010);Beckstead等(2005)報道20E以EcR依賴性的方式抑制抗菌肽defensin,cecropinC,attacinA,drosocin和drosomycin的表達,這或許表明激素對免疫的調節作用是劑量依賴性的。這種復雜性暗示了昆蟲體內存在多種不同的調控機制,20E調控體液免疫的關鍵基因,這些基因的作用途徑總結起來可以分為3類:(1) 依賴于Toll和IMD等先天免疫通路;(2) 依賴于胰島素(Insulin)信號途徑;(3) 依賴于20E信號通路因子BR-C等的直接調控(王遠等,2019)。Rus等(2013)提出果蠅通過兩個不同的機制調控AMPs的表達,一種機制是20E通過調控早期蛻皮激素誘導的轉錄因子(BR-C, Eip93F, Eip74EF, Eip78C和HR46)以及2個果蠅GATA因子(Serpent和Pannier),進而調控PGRP-LC ,通過IMD通路調控AMPs的表達;另一種是不依賴PGRP-LC而是通過BR-C、Serpent和Pannier影響一部分AMPs的表達,兩條通路之間存在交叉重疊。該模型解釋了在果蠅的先天性免疫中20E可以通過影響IMD信號途徑進而調控AMPs表達的機制。

昆蟲體液免疫主要由脂肪體(相當于哺乳動物的肝臟)中合成AMPs,分泌到血淋巴后通過開放的體液循環系統將其運送到其他組織器官,發揮系統性免疫作用(Lemaitre &Hoffmann, 2007; Eleftherianosetal.,2021)。20E對先天免疫的調節,既作用于昆蟲的系統免疫(Systemic immunity),也調節局部免疫(Local immunity),即通過某些局部器官或組織如中腸、表皮、馬氏管、氣管中合成的AMPs產生的局部免疫反應。最近的研究發現:化蛹期的果蠅抗真菌基因drosomycin(drs)及其家族同系物成員drosomycin-like2和drosomycin-like5的表達顯著增加,蛻皮激素信號調控脂肪體drosomycin和中腸drosomycin-like2的表達(Nunesetal., 2021)。果蠅胚胎氣管上皮中抗菌肽drosocin的表達同樣需要20E信號(Tanetal., 2014)。家蠶由幼蟲向蛹發育的變態期中腸中的模式識別受體(PRR)和AMPs基因表達上調(Xuetal., 2012),Mai等(2017)的研究揭示中腸抗菌肽lebocin的表達上調受到BmBR-C Z4和BmEts的調控。

本研究表明20E誘導家蠶脂肪體抗菌肽BmCeB6的表達,調控BmCeB6表達的順式元件存在于5′上游啟動子區-448～-170之間,該啟動子區域內存在的BR-C和E74A等結合位點是潛在的調控因子。下一步將通過對該啟動子區域做更精細的截短和雙熒光素酶活性分析,同時結合EMSA等方法獲得BmCecB6應答20E的調控元件。