蜂巢小甲蟲OBP4的克隆及表達譜分析

李良斌,武麗仙,許雅靜,3,劉家莉,趙紅霞*

(1.華南農業大學植物保護學院,廣州 510642;2. 廣東省科學院動物研究所,廣東省野生動物保護與利用公共實驗室,廣東省動物保護與資源利用重點實驗室,廣州 510260;3. 福建農林大學動物科學學院(蜂學學院),福州 350002)

蜂巢小甲蟲Aethinatumida屬鞘翅目Coleoptera露尾甲科Nitidulidae,是一種世界范圍內的入侵性害蟲,于2017年入侵我國廣東省,對當地的養蜂業造成了嚴重損失(張明明等, 2021)。蜂巢小甲蟲成蟲和幼蟲均以蜂蜜和花粉為食,爭奪蜜蜂幼蟲的食物,嚴重時會導致蜜蜂發生逃群現象;同時還會導致蜂蜜發酵,巢脾發臭等一系列后果,嚴重影響蜂群健康和蜂產品品質(Neumannetal., 2004)。蜂巢小甲蟲的幼蟲在發育到13～14日齡左右,就會進入游走期,爬出蜂箱,尋找化蛹場所,待羽化為成蟲后繼續飛回蜂巢內產卵(Neumannetal., 2013)。

昆蟲嗅覺系統在許多生理和行為活動中發揮著重要作用,如尋找合適的寄主、食物來源、產卵地點和交配伙伴(Breer, 2003)。昆蟲的外周嗅覺系統負責識別和轉運外部的氣味分子,將化學信號轉化為電生理信號;中樞神經系統負責傳導電生理信號并引起昆蟲的氣味識別反應(Britoetal., 2016)。嗅覺系統是一個極其復雜的通路,涉及多種蛋白質,包括氣味結合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、化學感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、氣味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)、氣味受體(odorant receptors, ORs)和感覺神經元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)(杜亞麗等, 2020)。

OBP是一類小分子水溶性蛋白,大量存在于嗅覺感受器的淋巴液中,承擔著識別外界氣味物質并將其結合轉運到氣味受體OR上的功能(Fanetal., 2011)。最初,在鱗翅目中,OBPs依據基因功能和氨基酸序列的同源性分類為普通氣味結合蛋白(general odorant binding proteins,GOBPs)、信息素結合蛋白(pheromone binding protein,PBP)和觸角特異性結合蛋白(antennal binding proteins,ABPs),但是該方法在其他昆蟲中并不適用;根據OBPs含有保守半胱氨酸(Cys)的數量可以分為Classical OBPs,Minus-C OBPs,Plus-C OBPs,Dimer OBPs和Atypical OBPs(Rihanietal., 2021)。昆蟲OBP的數量也大不相同,隨著基因組和轉錄組測序的發展,先后在桔小實蠅Bactroceradorsalis、飛蝗Locustamigratoria和德國小鐮Blattellagermanica等昆蟲中鑒定出多個OBPs(Guoetal., 2018; Liuetal., 2020; Heetal., 2022)。但是目前關于蜂巢小甲蟲的OBPs研究還相對欠缺,筆者通過搜索蜂巢小甲蟲的基因組數據庫和轉錄組數據庫,并首次克隆得到一個新的OBP基因,將其命名為AtumOBP4,通過qRT-PCR分析了該基因的表達模式,為深入研究AtumOBP4基因在蜂巢小甲蟲嗅覺識別過程中的功能奠定基礎,也為以OBP為分子靶標防治蜂巢小甲蟲提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

試驗用蜂巢小甲蟲由廣東省科學院動物研究所蜜蜂中心人工飼養,成蟲和幼蟲均以蜂蜜、茶花花粉1∶2配比混合后的蜂蜜花粉糊飼喂,飼養條件為溫度28±2℃,相對濕度75%～80%,光周期0 L∶24 D(Wuetal., 2021)。

1.2 主要試劑和儀器

Total RNA提取試劑盒RNAex Pro Reagent、cDNA第一鏈合成試劑盒EvoM-MLV RT Mix Kit With gDNA Clean for qPCR、熒光定量試劑盒SYBR Green Priemix Pro Taq HS qPCR Kit等試劑均購于湖南艾科瑞(AG)生物工程有限公司;膠回收試劑盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit購于OMEGA公司;PCR反應試劑2×Es Taq MasterMix購自北京康為世紀生物科技有限公司;克隆載體pEASY-T3 Cloning Kit、表達感受態BL21(DE3)和克隆感受態細胞Trans1-T1均購于北京全式金生物有限公司;同源重組試劑盒ClonExpress?II One Step Cloning Kit購于Vazyme公司;內切酶Not I和EcoR I購于Takara公司;梯度PCR儀和實時熒光定量PCR儀CFX ConnectTMOptics Module由美國BIO-RAD公司生產,紫外凝膠成像分析系統由上海天能科技有限公司生產,研磨儀CRINDER GT100由北京格瑞德曼儀器設備有限公司生產,冷凍離心機Sigma 3K15由Sigma公司生產,紫外分光光度計由BIONANO由美國賽默飛世爾科技公司生產。

1.3 總RNA提取及cDNA的合成

收集蜂巢小甲蟲卵、幼蟲、蛹和雌雄成蟲;解剖蜂巢小甲蟲羽化后第7天的頭部、表皮、鞘翅、足部、脂肪體、腸道、馬氏管、精巢和卵巢共9個組織部位;另外,收集羽化后不同日齡(1～8 d)蜂巢小甲蟲的頭部。每15個樣本作為一個生物學重復,共設3個生物學重復。將收集的樣本置于液氮中速凍并研磨,參照RNAex Pro Reagent試劑盒說明書提取總RNA。以1 μg RNA為模板參照EvoM-MLV RT Mix Kit With gDNA Clean for qPCR反轉錄試劑盒說明書合成cDNA,-20℃保存。

1.4 AtumOBP4基因的克隆

搜索蜂巢小甲蟲轉錄組(Wuetal., 2021)和基因組數據庫(Evansetal., 2018)得到蜂巢小甲蟲OBP序列,使用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)。以文中1.3部分合成的第7天蜂巢小甲蟲頭部cDNA為模板,克隆蜂巢小甲蟲OBP基因的開放閱讀框序列。PCR反應體系(50 μL):PCR Mixture 25 μL,cDNA模板1.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,ddH2O 22 μL。PCR反應條件:98℃預變性1 min;98℃變性30 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個循環;72℃終延伸10 min。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證,并將符合預期大小的目的片段純化,并連接到pEASY-T3載體上,轉化至大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞中,37℃培養12 h,菌液PCR驗證后,挑選3管送生工生物測序。

表1 本試驗所用引物

1.5 AtumOBP4基因的序列分析

將克隆測序得到的蜂巢小甲蟲OBP序列在NCBI中用Blastn(http://blast. ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)工具進行核酸序列的同源性分析;利用在線軟件ORF Finder(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找序列的開放閱讀框,用DNAMAN軟件預測其編碼的氨基酸序列。運用在線工具NCBI Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析保守結構域;運用在線工具TMHMM-2.0對AtumOBP4進行跨膜結構的預測,利用在線網址Swiss-model為模板進行AtumOBP4三維結構預測;利用NCBI在線工具Constraint-based Multiple Alignment(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi)進行氨基酸多序列比對,采用MEGA 7.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹,Bootrap為1 000次。

1.6 AtumOBP4的時空表達

以文中1.3部分中得到的cDNA為模板,選取GAPDH作為內參基因,利用Primer Premier 5.0設計定量引物(表1),委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。使用SYBR Green Priemix Pro Taq HS qPCR Kit試劑盒進行熒光定量PCR。反應體系(20 μL):cDNA模板3 μL,SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL,上下游引物各0.8 μL,ddH2O 5.4 μL。反應程序:95℃預變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火及延伸30 s,40個循環;生成溶解曲線的程序為65℃ 5 s,95℃ 5 s。每個反應均進行3次生物學重復和2次技術重復。

1.7 AtumOBP4的原核表達

根據基因AtumOBP4和表達載體pET-32a(+)的序列,設計帶有NotⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點的特異性引物(表1)。以文中1.4中測序正確的菌液為模板,使用2×Es Taq MasterMix DNA聚合酶進行擴增,產物經割膠回收后測濃度置于-20℃冰箱備用。將表達載體pET-32a(+)用NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切,產物經瓊脂糖凝膠電泳確認酶切成功后回收備用。參照ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit說明書將雙酶切的pET-32a(+)載體與回收的目的片段進行同源重組,并轉化到Trans1-T1感受態細胞中。轉化后菌液涂布在含有100 μg/mL氨芐的LB固體培養基平板中,37℃倒置培養16 h。挑取平板中大小適中的菌落到1.5 mL LB液體培養基中(含氨芐100 μg/mL),37℃ 200 rpm振蕩培養2 h。菌液PCR擴增后經電泳檢測后,挑取目的片段范圍內的菌液送生工生物測序。

將測序正確的菌液擴大培養,通過質粒提取試劑盒提取質粒,將提取的pET-32a(+)/AtumOBP4質粒轉化BL21表達感受態細胞中,轉化后菌液涂布在含有100 μg/mL氨芐的LB固體培養基平板中,37℃倒置培養16 h。挑取平板中大小適中的菌落到8 mL LB液體培養基中(含氨芐100 μg/mL),37℃ 200 rpm振蕩培養2 h。以1%的接種量將過夜培養的菌液接入100 mL的LB液體培養基中(含氨芐100 μg/mL),37℃ 200 rpm振蕩培養至OD600≈0.7時,加入IPTG(終濃度1 mmol/L)誘導表達,25℃ 200 rpm繼續振蕩培養12～16 h。收集菌體,超聲波破碎及分離上清及包涵體。使用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況及表達形式。

1.8 數據分析

通過Bio-Rad CFX Maestro 1.1軟件對熒光定量的結果進行分析,采集目的基因和內參基因Ct值,用2-△△Ct相對定量法求得基因的相對表達量(Schmittgen, 2001)。使用SPSS 19.0軟件進行Tukey’s(HSD)單因素方差分析,結果以平均數±標準誤(Mean±SE)表示,通過GraphPad Prism 8.0軟件進行圖形分析。

2 結果與分析

2.1 克隆及序列分析

克隆獲得了一個新的蜂巢小甲蟲氣味結合蛋白基因,命名為AtumOBP4(GeBank登錄號: ON813082)(圖1)。基因AtumOBP4開放閱讀框全長465 bp,編碼154個氨基酸,預測其分子量大小為17.4 kDa,理論等電點為5.07。SignalP-4.1在線預測該蛋白N末端的前23個氨基酸為信號肽序列(圖2);跨膜結構域預測表明該蛋白不是跨膜蛋白;NCBI Conserved Domains對蛋白AtumOBP4的保守結構域分析表明它在第27～142位氨基酸具有PBP-GOBP superfamily家族的保守結構域。

圖1 AtumOBP4基因PCR產物電泳圖

圖2 AtumOBP4核苷酸序列及推導的氨基酸序列

2.2 氨基酸序列對比及系統發育分析

利用NCBI中的Blastp對AtumOBP4進行同源性搜索,發現其與鞘翅目昆蟲的OBP同源性較高,將AtumOBP4與其它9個鞘翅目昆蟲OBPs進行序列對比發現,這些序列都具有6個典型的半胱氨酸殘基,且分布方式為符合Classical-OBP家族 6個保守的半胱氨酸位點結構模型:C1-X20-66-C2-X3-C3-X21-43-C4- X8-14-C5-X8-C6(圖3)。

圖3 AtumOBP4與其他鞘翅目昆蟲OBP的序列比對

將以上序列通過MEAG 7.0構建系統進化樹,結果顯示AtumOBP4與TmolOBP8聚在同一支上,表明蜂巢小甲蟲與黃粉蟲可能有相同的基因起源(圖4)。

圖4 AtumOBP4與其他鞘翅目昆蟲OBP的系統發育樹(鄰接法)

2.3 AtumOBP4的時空表達

以成蟲足部的基因AtumOBP4表達量為基準,通過qRT-PCR分析基因AtumOBP4在蜂巢小甲蟲不同組織、不同發育階段(整蟲)以及羽化后不同日齡頭部的表達情況。結果顯示在蜂巢小甲蟲的卵期、幼蟲期、蛹期、雄性成蟲和雌性成蟲中,基因AtumOBP4均有表達;在雄性成蟲中的表達量最高,顯著高于卵期、蛹期和雌性成蟲中的表達(P<0.05),雄性成蟲的表達量是雌性成蟲的8.21倍(圖5-A)。AtumOBP4在蜂巢小甲蟲的頭(包含觸角)、翅、足、表皮、脂肪體、腸道、馬氏管、精巢和卵巢中均有表達,但表達量各有差異。頭部(包含觸角)的表達量最高,極顯著高于其他組織(P<0.001),脂肪體的表達量僅次于頭部,但與其它組織并無顯著性差異(圖5-B)。在蜂巢小甲蟲羽化后的第1～7天,AtumOBP4呈總體上升的趨勢,在第7天達到最高,第8天開始下降(圖5-C)。

圖5 AtumOBP4在蜂巢小甲蟲不同發育階段(A)、成蟲不同組織部位(B)和羽化后成蟲不同日齡頭部(C)的表達分析

2.4 AtumOBP4原核表達

將生工生物測序正確的pET-32a(+)/AtumOBP4的原核表達載體,轉入BL21感受態細胞中進行誘導表達。經過條件優化,在菌液OD600≈0.7時,加入IPTG(終濃度1 mmol/L),25℃,200 r/min誘導12 h后,大量表達,超聲破碎對上清和包涵體進行分離,用SDS-PAGE電泳檢測,目的蛋白主要在包涵體中大量表達。SDS-PAGE結果顯示,含有His-tag的重組蛋白分子量約在35 kDa,與預測的重組蛋白大小一致(圖6)。

圖6 AtumOBP4蛋白誘導表達

3 結論與討論

氣味結合蛋白OBPs在昆蟲的嗅覺識別系統中起著至關重要的作用,對于昆蟲覓食、尋找合適的產卵地以及交配等行為具有重要的意義(Leal, 2012)。隨著轉錄組技術的發展,越來越多昆蟲的OBPs被鑒定出來,前期研究中筆者所在團隊通過轉錄組和基因組數據分析鑒定出29個蜂巢小甲蟲OBPs(Wuetal., 2021)。本研究克隆出一個新的蜂巢小甲蟲氣味結合蛋白基因AtumOBP4,開放閱讀框序列全長465 bp,編碼154個氨基酸,預測其分子量大小為17.4 kDa,含有6個保守的半胱氨酸位點,從屬于典型的OBPs家族。進化樹結果表明AtumOBP4與黃粉蟲TmolOBP8的聚在同一分支,表明它們在進化關系上同源關系更近,可能發揮類似的普通氣味結合蛋白的功能,負責識別一般氣味(Liuetal., 2015)。

研究表明,觸角高表達的OBPs往往在昆蟲的嗅覺系統中發揮著重要的作用(張雪等, 2021)。例如在美洲斑潛蠅Liriomyzasativae觸角特異性高表達的LsatOBP13參與對寄主綠葉植物中大量存在的氣味物質的識別過程,在美洲斑潛蠅嗅覺識別、寄主植物定位中發揮功能(陳東凱等, 2018)。本研究發現AtumOBP4在蜂巢小甲蟲頭部(包含觸角)特異性高表達,與上述研究相符,表明AtumOBP4可能是參與蜂巢小甲蟲多種嗅覺識別的重要蛋白。OBPs除了參與嗅覺識別外,還可能在昆蟲的其它組織參與各種生理活動,例如參與卵膜形成、味覺識別和營養物質運輸等,意味著OBPs也在昆蟲的各種組織部位表達(Costa-da-Silvaetal., 2013; 張方梅等, 2019)。AtumOBP4基因在蜂巢小甲蟲的翅、足、表皮、腸道、脂肪體、馬氏管、精巢和卵巢等組織中均有一定的表達量;在馬氏管、腸道的表達量要略高于其它組織,暗示著AtumOBP4可能在消化系統中發揮一定的作用,類似的現象也出現在伏蠅Phormiaregina和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera等昆蟲(張帥等, 2012; Ishidaetal., 2013)。本研究還發現AtumOBP4在蜂巢小甲蟲的不同發育階段均有表達,幼蟲期的表達量高于卵期和蛹期,可能與蜂巢小甲蟲幼蟲相較于卵和蛹存在更豐富的取食行為與更廣泛的活動范圍有關。OBP基因在雌雄成蟲中普遍存在偏向表達,如綠豆象Callosobruchuschinensis雄成蟲各組織中CchiOBP1的表達量顯著高于雌成蟲的,推測該基因可能在雌雄之間交配時,或是與寄主互作的過程中發揮重要作用(王宏民等, 2021);韭菜遲眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga雌性高表達的BodoOBP5在識別寄主揮發物和性信息素中發揮重要功能(Yangetal., 2021)。本研究中,雄性成蟲中AtumOBP4的表達量明顯高于雌性成蟲,這可能與蜂巢小甲蟲的交配行為相關,事實上蜂巢小甲蟲不僅存在雌雄交配,還存在嘗試性雄雄交配行為(Neumannetal., 2008; Mustafaetal., 2015)。在羽化后不同天數頭部表達譜分析表明,AtumOBP4在羽化后的1～7天內呈現逐漸升高的趨勢,第5～7天呈現穩定的較高水平表達,在第7天達到最高,第8天開始降低。蜂巢小甲蟲在羽化后的5～7天性成熟,開始尋找配偶和寄主蜂箱(Neumannetal., 2016)。頭部是昆蟲感覺和取食的中心,在其表面分布著大量的嗅覺感受器(Matsuoetal., 2007)。因此推測在蜂巢小甲蟲羽化后第7天頭部高度表達的AtumOBP4參與了性信息素和蜂巢相關氣味的嗅覺識別過程。

OBPs作為嗅覺結合蛋白,最重要的功能是在嗅覺系統中結合轉運氣味和信息素分子;OBPs為球狀結構,親水性氨基酸分布于蛋白表面,使它們具有強水溶性,疏水性氨基酸在內部形成空腔,用于結合配基(吳帆等, 2021)。因此進一步研究氣味結合蛋白的功能需要通過表達蛋白來實現,本研究成功的建立了基因AtumOBP4原核表達體系,并成功在包涵體中表達出AtumOBP4蛋白,與Li等(2021)的研究結果一致,可用于下一步的熒光競爭結合研究,并通過RNAi技術來進行功能驗證。