多模式超聲波預(yù)處理促進(jìn)克氏原螯蝦酶解效果的優(yōu)化

張 超， 韓 暢， 馮 敏， 阮文燕， 楊浩澤，徐保國*,2， 顏偉強(qiáng)， 周存山， 馬海樂,2

（1. 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學(xué)食品物理加工研究院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.匯能生物科技（江蘇）有限公司，江蘇淮安 223199）

克氏原螯蝦是一種在淡水中生活的硬殼類動物[1]。 20 世紀(jì)20 年代，日本從美國引入克氏原螯蝦，1930 年前后從日本流入中國[2]。 近年來，我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速。據(jù)統(tǒng)計，在2003 至2018年這十幾年的時間里，我國的養(yǎng)殖量從5.16 萬t 快速增長至163.87 萬t， 尤其在2018 年增幅最大，達(dá)到45.1%[3]。 據(jù)統(tǒng)計，僅2018 年一年，克氏原螯蝦就創(chuàng)造了超過3 500 億元的產(chǎn)值，同比增長了近40%[4]。克氏原螯蝦作為重要的水產(chǎn)品，受到更多消費(fèi)者的喜愛[5-6]。

超聲波上是一種由于機(jī)械振動所產(chǎn)生的能量在媒介中傳遞的過程，其頻率一般在20 kHz 以上[8-9]，被大量用于食品行業(yè)，特別是在酶解等方面。 超聲在酶解反應(yīng)中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面：底物酶解前的超聲預(yù)處理、邊酶解邊超聲底物和超聲處理酶方面[10]。 利用超聲波對含有蛋白質(zhì)的底物酶解前進(jìn)行預(yù)處理， 不僅可以明顯增加蛋白質(zhì)利用率、酶的酶解率和產(chǎn)物的質(zhì)量[11]，還能有效降低反應(yīng)時間，從而降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。 超聲波引起的空化是一種物理和化學(xué)反應(yīng)[12]，并非引起空化就能形成明顯的空化反應(yīng)，只有保證超聲的介質(zhì)溫度、機(jī)器功率、發(fā)射頻率和反應(yīng)時間等條件比較恰當(dāng)時， 空化核心才能成長為能形成空化反應(yīng)的氣泡，并產(chǎn)生有效的空化效應(yīng)[13]。 當(dāng)空化氣泡坍塌時，在氣泡周圍極小的空間內(nèi)會發(fā)生物理化學(xué)相互作用和特別的物理作用，這為超聲能成功的加強(qiáng)酶解反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)[14]。

雖然超聲技術(shù)在酶解過程中的應(yīng)用很常見，但是將多模式超聲波技術(shù)應(yīng)用于克氏原螯蝦酶解工藝中的研究卻少有報道。 作者利用不同的超聲機(jī)器對克氏原螯蝦進(jìn)行實驗[15]，提高酶解反應(yīng)速率，減少生產(chǎn)所需時間，這對于增加其附加值，拓寬應(yīng)用市場具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料

克氏原螯蝦：市售產(chǎn)品。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器探頭式雙頻超聲設(shè)備：江蘇大學(xué)自主研制（見圖1（a））；三頻超聲波反應(yīng)設(shè)備：江蘇大學(xué)自主研制（見圖1（b））；離心機(jī)：LD5-2A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品。

圖1 多模式超聲設(shè)備圖Fig. 1 Devices of multi-mode ultrasound equipiment

1.2.2 主要試劑氫氧化鈉、 濃硫酸、 濃鹽酸、甲醛、硼酸、甲基紅、鄰苯二甲酸氫鉀、溴甲酚綠：分析純，國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方案

挑選飽滿正常、大小適中的克氏原螯蝦，用超聲波清洗機(jī)清洗后， 按照蝦和水質(zhì)量比為1∶2 加入蒸餾水，然后使用多功能破壁機(jī)將原料進(jìn)行破碎處理。 將蝦漿液放入真空包裝袋，使用不同模式的超聲波機(jī)器對其進(jìn)行超聲處理，超聲完成后加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。 酶解的條件是： 酶解時間3 h，加酶量2 000 U/g、pH 8.0、溫度60 ℃；酶解反應(yīng)完成后， 迅速放入95 ℃的水浴鍋中滅酶， 滅酶10 min 后，在5 000 r/min 離心10 min，取克氏原螯蝦酶解液的上清液測定水解度。 選擇的單因素試驗條件分別為超聲功率、時間、頻率和超聲溫度，考察超聲預(yù)處理對克氏原螯蝦酶解的影響。

1.4 水解度測定

參照GB 5009.235—20100 的方法對克氏原螯蝦酶解液中的氨基酸態(tài)氮進(jìn)行測定， 量取5.00 mL克氏原螯蝦底物的酶解上清液至100 mL 容量瓶，混勻后吸取20~200 mL 燒杯，然后吸取60 mL 的蒸餾水加入其中， 用儀器攪拌混勻。 用0.05 mol/L NaOH 溶液滴定至pH 8.20， 準(zhǔn)確量取10.00 mL 甲醛溶液加入其中后攪勻， 接著用0.05 mol/L 的NaOH 溶液進(jìn)行滴定，滴定到pH 到9.20。 對照實驗用80 mL 蒸餾水。 記錄相關(guān)溶液的所用體積，然后進(jìn)行計算。 運(yùn)算公式如下：

式中：A為底物所含的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，g/dL；V1為第二次滴定時氫氧化鈉所用試樣的體積，mL；V2為空白對照所用試液的體積，mL；V3為將原料稀釋后消耗的體積，mL；V4為將原料稀釋后的總體積，mL；V為所用試樣的體積，mL；C為所使用的氫氧化鈉溶液濃度，mol/L。

式中：DH 為水解度，%；AN為克氏原螯蝦離心液上清液中氨基態(tài)氮的質(zhì)量濃度，g/dL；AN1為克氏原螯蝦原液未水解時的游離態(tài)氨基酸質(zhì)量濃度，g/dL；N為克氏原螯蝦原液中的總氮質(zhì)量濃度，g/dL。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗重復(fù)3 次，最終結(jié)果以數(shù)值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示， 使用SPSS 26.0 分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 探頭式雙頻超聲預(yù)處理對克氏原螯蝦酶解的影響

2.1.1 不同超聲功率對酶解反應(yīng)的影響將超聲條件設(shè)置為：超聲溫度40 ℃、超聲時間10 min、超聲頻率為順序雙頻超聲20/28 kHz、 超聲功率依次為0、125、250、375、500 W，在此基礎(chǔ)上將克氏原螯蝦原液進(jìn)行完實驗后，立即按照酶解實驗要求進(jìn)行反應(yīng)，然后測量克氏原螯蝦酶解液的水解度，用水解度來衡量酶解效果，考察不同超聲功率對酶解效果的影響。

從圖2 可知，當(dāng)超聲的功率不斷增大時，水解度是先增加后減少。在超聲功率為250 W 時水解度達(dá)到最大，這可能是由于超聲波功率在一定范圍內(nèi)可以使蛋白質(zhì)分子的構(gòu)造發(fā)生變化，隨著超聲功率的加大，超聲波處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)也加強(qiáng)，顯露出原來位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的部分，增加了和酶的接觸點，使酶促反應(yīng)速率加快，從而提高了水解度。但當(dāng)超聲功率進(jìn)繼續(xù)加大時， 水解度反而減小，原因或許是因為當(dāng)超聲功率進(jìn)一步加大時，會改變原本容易和酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致超聲功率雖然增大，但不能使反應(yīng)的效果同步加強(qiáng)[16]。所以最佳的超聲頻率為250 W。

圖2 不同超聲功率對水解度的影響Fig. 2 Effect of different ultrasonic power on degree of hydrolysis

2.1.2 不同超聲時間對酶解反應(yīng)的影響將超聲條件設(shè)置為：超聲溫度40 ℃、超聲功率250 W、超聲頻率為20/28 kHz、超聲時間依次為5、10、15、20、25 min，在此基礎(chǔ)上將克氏原螯蝦原液進(jìn)行實驗后，遵循酶解實驗要求進(jìn)行反應(yīng)，然后測量克氏原螯蝦酶解液的水解度，用水解度來衡量酶解效果，考察不同超聲時間對酶解效果的影響。

從圖3 能夠發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時間增加時，水解度先是隨著時間的增長而增大， 并在10 min 時達(dá)到最大，然后水解度緩慢減小。 這可能是因為超聲波會產(chǎn)生空化效應(yīng)時，空化效應(yīng)在短時間內(nèi)會隨著超聲時間的增加而增強(qiáng)，所以適當(dāng)?shù)目栈?yīng)可以使酶促反應(yīng)速率加快和水解度升高。但當(dāng)時間超過10 min 后水解度有所下降，可能是由于過長的超聲時間使原本能和酶接觸反應(yīng)的結(jié)構(gòu)遭到了破壞，使酶解過程受到阻礙[17]。 所以最佳的超聲時間為10 min。

圖3 不同超聲時間對水解度的影響Fig. 3 Effect of different ultrasonic time on degree of hydrolysis

2.1.3 不同超聲溫度對酶解反應(yīng)的作用將超聲條件設(shè)置為： 超聲時間為10 min、 超聲功率為250 W、 超聲頻率20/28 kHz、 超聲溫度依次為30、35、40、45、50 ℃，在此基礎(chǔ)上將克氏原螯蝦原液進(jìn)行實驗，按照酶解實驗要求進(jìn)行反應(yīng)，然后測量克氏原螯蝦酶解液的水解度， 用水解度來衡量酶解效果，考察不同超聲溫度對酶解效果的影響。

從圖4 可以看出，隨著溫度的上升，克氏原螯蝦酶解液的水解度先增大再減小， 在35 ℃時達(dá)到最大，其原因可能是細(xì)胞壁被超聲波擊破，擴(kuò)大了蛋白質(zhì)與酶接觸的面積， 有利于蛋白酶解反應(yīng)的發(fā)生。然而，隨著溫度的繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)可以和酶接觸的結(jié)構(gòu)會被超聲波不斷破壞， 因此水解度出現(xiàn)不斷下降的現(xiàn)象[18]，因此最佳的超聲溫度為35 ℃。

圖4 不同超聲溫度對水解度的影響Fig. 4 Effect of different ultrasonic temperatures on degree of hydrolysis

2.1.4 不同超聲頻率對酶解反應(yīng)的作用將超聲條件設(shè)置為： 超聲時間為10 min、 超聲功率為250 W、超聲溫度40 ℃，調(diào)節(jié)超聲頻率分別為單頻20、28、35 kHz，順序雙頻20/28、20/35、28/35 kHz，同步雙頻20+28、20+35、28+35 kHz， 在此基礎(chǔ)上將克氏原螯蝦原液進(jìn)行實驗后，遵循酶解實驗要求進(jìn)行反應(yīng)，然后測量克氏原螯蝦酶解液的水解度，用水解度來衡量酶解效果，考察不同超聲頻率對酶解效果的影響。

從圖5 可以看出，不同的超聲頻率對水解度的影響不同。 單頻超聲時，克氏原螯蝦酶解液的水解度隨著頻率的增大而增大，其原因可能是隨著超聲頻率的不斷增大，底物中的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了變化，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。 順序雙頻與同步雙頻超聲時，酶解液的水解度隨著頻率的增大反而減小，其原因可能是隨著超聲頻率的增大，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象進(jìn)一步改變，影響了酶解反應(yīng)的進(jìn)行[19]。通過SPSS 26.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，發(fā)現(xiàn)不同頻率之間均存在顯著性差異（P<0.05）。 當(dāng)超聲頻率為20/28 kHz 時水解度最大， 所以最佳的超聲頻率為20/28 kHz。

圖5 不同超聲頻率對水解度的影響Fig. 5 Effect of different ultrasonic frequency on degree of hydrolysis

2.1.5 Box-Beknken 實驗在超聲實驗的基礎(chǔ)上，將考察因數(shù)設(shè)置為超聲功率、時間和溫度，水解度為響應(yīng)值進(jìn)行設(shè)計。通過Design expert 11 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和實驗設(shè)計，優(yōu)化探頭式雙頻超聲的實驗條件，克氏原螯蝦Box-Beknken 實驗的因素與水平如表1 所示。

表1 克氏原螯蝦響應(yīng)面分析的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis of Procambarus clarkii

2.1.6 優(yōu)化實驗及方差分析根據(jù)所設(shè)計的響應(yīng)面實驗， 確定超聲波實驗不同因數(shù)的最佳條件，實驗結(jié)果如表2、3 所示。

表2 實驗方案與結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據(jù)表2 中所輸入的實驗數(shù)據(jù)可以由design expert 11 軟件得出M（水解度）與各個因素間的回歸方程為：

由上表可知，此模型的P<0.000 1，所以該模型方程極為顯著； 又因為此模型的失擬項P值為0.091 3，大于0.05，所以不顯著，因此該方程成立。而且超聲時間、 溫度和功率的P值均小于0.000 1，所以它們對水解度有極顯著的影響， 影響程度為：功率＞時間＞溫度。 由r2=0.981 2，r2Adj=0.931 6 可知，該模擬方案的擬合度和可信度均符合要求，所以可以用于實驗的理論預(yù)測。

2.1.7 因素間交互作用分析利用軟件做出響應(yīng)曲面圖，分析超聲功率、時間、溫度之間的交互作用，得出超聲功率、時間、溫度對于克氏原螯蝦酶解液的最佳工藝條件，結(jié)果如圖6~8 所示。

圖6 超聲功率與時間對水解度的影響Fig. 6 Effect of ultrasonic power and time on degree of hydrolysis

圖7 超聲功率與溫度對水解度的影響Fig. 7 Effect of ultrasonic power and temperature on degree of hydrolysis

圖8 超聲時間與溫度對水解度的影響Fig. 8 Effect of ultrasonic time and temperature on degree of hydrolysis

從以上的3 張圖可得出，3 種因素之間的交互作用都不明顯，因此實驗的最佳條件為：超聲功率251.22 W，時間10.36 min，溫度35.68 ℃，水解度為39.22%。 為了能夠在實際生產(chǎn)中實現(xiàn)，將最佳工藝參數(shù)取整，調(diào)整為：超聲的功率為250 W，時間為10 min，溫度為35 ℃，進(jìn)行3 次驗證實驗，酶解實驗水解度的平均值為38.98%， 與模型理論值相差0.24%，證明回歸方程有很高的擬合度和實用效果，所以該實驗的可行性高。

2.2 三頻超聲波預(yù)處理對克氏原螯蝦酶解的影響

2.2.1 不同超聲功率對酶解反應(yīng)的作用將超聲條件設(shè)置為：超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min、超聲頻率為20/40 kHz、 超聲功率依次為0、125、 250、375、500 W， 在此基礎(chǔ)上將克氏原螯蝦原液進(jìn)行實驗后，按照酶解實驗要求進(jìn)行反應(yīng)，測量克氏原螯蝦酶解液的水解度， 用水解度來衡量酶解效果，考察不同超聲功率對酶解效果的影響。

從圖9 可知，當(dāng)功率增大時，克氏原螯蝦酶解液水解度先增加后減少。在超聲功率為250 W 時水解度最高， 這可能是由于當(dāng)超聲波功率較低時，產(chǎn)生的空化作用較為緩和，顯露出原來位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，更易與酶結(jié)合。 但當(dāng)超聲功率繼續(xù)加大時，水解度變化趨勢轉(zhuǎn)變?yōu)椴粩嘞陆怠?這是因為超聲波功率過大反而會破壞了蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，使水解度反而下降[20]。所以最佳的超聲功率為250 W。

圖9 不同超聲功率對水解度的影響Fig. 9 Effect of different ultrasonic power on degree of hydrolysis

2.2.2 不同超聲時間對酶解反應(yīng)的影響將超聲條件設(shè)置為：超聲溫度40 ℃、超聲功率500 W、超聲頻率為20/40 kHz、 超聲時間依次為10、20、30、40、50 min，在此基礎(chǔ)上將克氏原螯蝦原液進(jìn)行實驗，按照酶解實驗要求進(jìn)行反應(yīng)，測量克氏原螯蝦酶解液的水解度，用水解度來衡量酶解效果，考察不同超聲時間對酶解效果的影響。

當(dāng)時間增加時，克氏原螯蝦酶解液的水解度先是上升，然后隨著時間的延長下降（見圖10）。 這是因為隨著時間的增加，超聲波使蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)被逐漸破壞，更多的酶結(jié)合位點被暴露出來。 但是當(dāng)超聲時間過長，暴露出的結(jié)合位點也會被逐漸破壞， 所以當(dāng)時間超過40 min 后水解度反而下降[21]。所以最佳的超聲時間為40 min。

圖10 不同超聲時間對水解度的影響Fig. 10 Effect of different ultrasonic time on degree of hydrolysis

2.2.3 不同超聲溫度對酶解反應(yīng)的作用將超聲條件設(shè)置為：超聲時間30 min、超聲功率500 W、超聲頻率為20/40 kHz、 超聲溫度依次為30、35、40、45、50 ℃， 在此基礎(chǔ)上將克氏原螯蝦原液進(jìn)行實驗后，按照酶解實驗要求進(jìn)行反應(yīng)，然后測量克氏原螯蝦酶解液的水解度，考察不同超聲溫度對酶解效果的影響。

從圖11 可知，當(dāng)溫度升高時，克氏原螯蝦酶解液的水解度先增加后減少。 在超聲溫度為40 ℃時水解度最高， 其原因可能是在超聲溫度較低時，隨著溫度的不斷升高，分子活性增大，蛋白質(zhì)易受到超聲的作用更容易降解，有利于酶解的進(jìn)行。 當(dāng)超聲介質(zhì)的溫度繼續(xù)升高時，使部分可以和酶結(jié)合的活性片段被破壞，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，因此克氏原螯蝦酶解液的水解度反而下降[22]。 所以超聲的最佳溫度為40 ℃。

圖11 不同超聲溫度對水解度的影響Fig. 11 Effect of different ultrasonic temperature on degree of hydrolysis

圖12 不同超聲頻率對水解度的影響Fig. 12 Effect of different ultrasonic frequency on degree of hydrolysis

2.2.4 不同超聲頻率對酶解反應(yīng)的作用將超聲條件設(shè)置為：超聲溫度40 ℃、超聲功率500 W、超聲時間為30 min， 調(diào)節(jié)超聲頻率為單頻20、40、60 kHz， 順序20/40、20/60、40/60、20/40/60 kHz， 同步20+40、20+60、40+60、20+40+60 kHz，在此基礎(chǔ)上將克氏原螯蝦原液進(jìn)行實驗后，遵循酶解實驗要求進(jìn)行反應(yīng)， 然后測量克氏原螯蝦酶解液的水解度，用水解度來衡量酶解效果，考察不同超聲頻率對酶解效果的影響。

從圖11 可以看出， 不同的超聲頻率對水解度的影響不同。 單頻超聲時，克氏原螯蝦酶解液的水解度隨著頻率的增大而增大，其原因是經(jīng)超聲預(yù)處理后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分布發(fā)生了變化，有利于與酶作用。 順序雙頻與同步雙頻超聲時，水解度隨著頻率的增大反而減小，其原因可能是隨著超聲頻率的增大，原本易與酶作用的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，反而不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行[23]。 通過SPSS 26.0軟件進(jìn)行顯著性分析，發(fā)現(xiàn)除20 kHz 與40+60、400 kHz 與20+40 kHz 之間不存在顯著性差異（P>0.05）外，其余頻率之間均存在顯著性差異（P<0.05）。當(dāng)超聲頻率為20/40 kHz 時水解度最大， 所以最佳的超聲頻率為20/40 kHz。

2.2.5 Box-Beknken 實驗在超聲實驗的基礎(chǔ)上，將考察因數(shù)設(shè)置為超聲功率、時間和溫度，水解度為響應(yīng)值進(jìn)行設(shè)計，用Design expert 11 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和實驗設(shè)計， 優(yōu)化三頻超聲波的實驗條件，克氏原螯蝦Box-Beknken 實驗的因素與水平如表4所示。

表4 克氏原螯蝦響應(yīng)面分析的因素和水平Table 4 Factors and levels of response surface analysis of Procambarus clarkii

2.2.6 優(yōu)化實驗及方差分析根據(jù)所設(shè)計的響應(yīng)面實驗， 確定超聲波實驗不同因數(shù)的最佳條件，實驗結(jié)果如表5~6 所示。

表5 優(yōu)化實驗方案與結(jié)果Table 5 Optimization experimental scheme and results

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

根據(jù)表5 中所輸入的實驗數(shù)據(jù)可以由Design expert 11 軟件得出M（水解度）與各個因素間的回歸方程為：

由表3 可知，此模型的P值小于0.000 1，所以該模型方程極為顯著；又因為此模型的失擬項P值為0.610 1，大于0.05，所以不顯著，因此該方程成立。 且時間、溫度和功率的P值均小于0.000 1，所以它們對水解度有極顯著的影響， 影響程度為：功率＞時間＞溫度。 由r2=0.975 6，r2Adj=0.921 3 可知，該模擬方案的擬合度和可信度均符合要求，可用于實驗的理論預(yù)測。

2.2.7 因素間交互作用分析利用軟件做出響應(yīng)曲面圖，分析超聲功率、時間、溫度之間的交互作用，得出超聲功率、時間、溫度對于克氏原螯蝦酶解的最佳工藝條件，結(jié)果如圖13~15 所示。

圖13 超聲功率與時間對水解度的影響圖Fig. 13 Diagram of influence of ultrasonic power and time on degree of hydrolysis

圖14 超聲功率與溫度對水解度的影響圖Fig. 14 Diagram of influence of ultrasonic power and temperature on degree of hydrolysis

從以上多圖可得出，3 種因素之間的交互作用都是不明顯， 因此實驗的最佳條件為： 超聲功率253.50 W，時間40.64 min，溫度40.75 ℃，水解度為46.15%。 為了能夠在實際生產(chǎn)中實現(xiàn)，將最佳工藝參數(shù)取整，調(diào)整為：超聲的功率為250 W，時間為40 min，溫度為40 ℃，進(jìn)行3 次驗證實驗，酶解實驗水解度的平均值為46.12%， 與模型理論值相差0.03%，證明回歸方程有很高的擬合度和實用效果，該實驗的可行性高。

3 結(jié) 語

作者研究了超聲波預(yù)處理對克氏原螯蝦酶解的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法確定了超聲預(yù)處理的最佳條件。

1） 探頭式雙頻超聲設(shè)備的最佳超聲頻率為20/28 kHz 雙頻順序超聲，在此基礎(chǔ)上響應(yīng)面優(yōu)化確定的最佳處理條件為：超聲的功率為250 W，時間為10 min，溫度為35 ℃，此時克氏原螯蝦的水解度為38.98%。

2） 三頻超聲波設(shè)備的最佳超聲頻率為20/40 kHz 雙頻順序超聲， 在此基礎(chǔ)上響應(yīng)面優(yōu)化確定的最佳處理條件為：超聲的功率為250 W，時間為40 min，溫度為40 ℃，此時克氏原螯蝦的水解度為46.12%。