鈣離子協(xié)同溶氧提高重組β-CGT 酶的可溶性表達量

周媛媛， 李兆豐，2， 顧正彪，2， 班宵逢，2， 洪 雁，2， 程 力，2， 李才明*，2

（1. 江南大學(xué)食品學(xué)院， 江蘇無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國重點實驗室， 江蘇無錫 214122）

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase， 簡稱CGT 酶，EC 2.4.1.19） 是從細菌細胞中得到的一類胞外酶，它是α-淀粉酶大家族的關(guān)鍵成員[1-3]。 CGT 酶共有A~E 5 個結(jié)構(gòu)域，能夠催化4 種不同類型的反應(yīng)，分別為水解、歧化、環(huán)化和偶合反應(yīng)，具有極大的應(yīng)用價值[4-5]，近年來，隨著環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)以及化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，CGT 酶成為研究的熱點[6]。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種能夠天然生產(chǎn)CGT 酶的菌種， 大多數(shù)為細菌， 包括Paenibacillus macerans[7]、Bacillus stearothermophilus[8]、B. megaterium[9]等。

大部分來源的CGT 酶的熱穩(wěn)定性相對較低，而來源于B. xiaoxiensisSTB08 的CGT 酶的熱穩(wěn)定性較高（60 ℃下的半衰期為12.5 min）。 工業(yè)上生產(chǎn)環(huán)糊精所使用的CGT 酶主要來自天然芽孢桿菌，少量為基因工程菌[10-11]，相比野生菌在培養(yǎng)過程中容易感染雜菌、發(fā)生回復(fù)突變、發(fā)酵上清液中酶活單位低等特點，重組菌培養(yǎng)方式簡便，上清液中酶活單位高，目的蛋白質(zhì)所占比較大，都使得在發(fā)酵過程中制備CGT 酶的成本進一步降低。 但CGT 酶在發(fā)酵過程中， 經(jīng)常會遇到外源蛋白質(zhì)形成包涵體、胞外表達量難以提高等問題，限制了CGT 酶的大規(guī)模生產(chǎn)以及在工業(yè)中的應(yīng)用[12]。 因此，有必要提高CGT 酶的胞外表達量。

在合適的宿主中外源表達cgt基因被認為是目前提高CGT 酶產(chǎn)量的主要且有效的手段。大腸桿菌是實驗室研究和工業(yè)生產(chǎn)首選的表達系統(tǒng)，因此使用大腸桿菌系統(tǒng)來表達重組蛋白質(zhì)成為一種快速簡單的方法。 如Li 等利用大腸桿菌系統(tǒng)表達P.macerans的CGT 酶， 誘導(dǎo)90 h 時CGT 酶活力可達22.5 U/mL[13]。 但目前胞外表達量還是較低，且對發(fā)酵條件（如溶氧、鈣離子）影響大腸桿菌產(chǎn)酶的機理研究較少，同時有關(guān)溶氧以及鈣離子對大腸桿菌產(chǎn)酶的協(xié)同作用未見報道。 因此，有必要系統(tǒng)研究溶氧及鈣離子對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

作者將來源于B. xiaoxiensisSTB08 的β-CGT基因插入質(zhì)粒pET-20b（+）中，在宿主菌E. coliBL21 中進行分泌表達， 對能夠顯著影響β-CGT 酶發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵條件（溶氧、鈣離子）的影響機理進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種與質(zhì)粒：小溪芽孢桿菌B.xiaoxiensisSTB08、質(zhì)粒pET-20b（+）、表達宿主E. coliBL21（DE3）均由作者所在實驗室傳代并保藏。

1.2 主要儀器

Applied Biosystems Pro Flex PCR 儀： 美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；Mini Protein3 蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)：美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；T-6V 可見分光光度計： 南京菲勒儀器有限公司產(chǎn)品；FACS Aria II 流式細胞分選儀：美國碧迪公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

LB 液體培養(yǎng)基組分（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10；LB 固體培養(yǎng)基為在LB 液體培養(yǎng)基中再添加1.5 g/dL 的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基（組分g/L）：玉米漿膏24，大豆蛋白胨6， 葡萄糖2， 麥芽糖4，KH2PO42.32，K2HPO4·3H2O 16.43。

1.4 實驗方法

1.4.1 重組β-CGT 酶的生產(chǎn)種子培養(yǎng)：將保存在超低溫冰箱中的甘油管菌株解凍，混合均勻后使用移液槍吸取100 μL 至LB 液體培養(yǎng)基中， 然后在37 ℃發(fā)酵搖床中培養(yǎng)10~12 h。發(fā)酵培養(yǎng)：將得到的種子液使用移液槍吸取2 mL 至發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在30 ℃發(fā)酵搖床中培養(yǎng)96 h 得到重組β-CGT酶液。

1.4.2 β-CGT 酶環(huán)化活力的測定β-CGT 酶環(huán)化活力的測定參照李才明的方法[14]。

1.4.3 菌體濃度的測定通過光密度（Optical density）的大小來反映菌體數(shù)量，用OD600nm表示。

1.4.4 重組CGT 酶的亞細胞定位重組CGT 酶的定位參照李兆豐的方法[15]。 胞外CGT 酶：發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，上清液即為胞外β-CGT 酶；不溶性包涵體：在分離出周質(zhì)空間與胞內(nèi)CGT 酶的細胞碎片中加入1 g/dL SDSPAGE 上樣緩沖液，并在沸水浴中煮沸10 min，離心后的上清液即為不溶性包涵體。

1.4.5 細胞透性分析重組大腸桿菌細胞透性的測定參照李兆豐的方法[15]。 即發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min 離心20 min， 收集菌體，用PBS 洗滌2 遍， 稀釋至一定濃度后加入10 mmol/L NPN，用熒光分光光度計測定熒光值，測定參數(shù)為：縫寬1 nm、激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長420 nm。

富水軟弱地層中交叉、重疊隧道盾構(gòu)區(qū)間施工關(guān)鍵技術(shù)……………………………………………………… 楊義（10-213）

1.4.6 流式細胞儀（FCM）分析對于FCM 分析，參照文獻[16]使用碘化丙啶（PI）以及羧基二乙酰熒光素（cFDA）雙染的方法對細菌細胞進行染色，略有改動。 首先將不同條件下的細胞于42 ℃水浴中用cFDA 避光染色30 min，接著用PI 進行染色，染色的細菌需在1 h 內(nèi)進行FCM 分析。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理使用Prism graphpad 8.0 軟件作圖，使用SPSS 26.0 中的單因素方差分析（ANOVA）對數(shù)據(jù)進行顯著性分析（P<0.05），流式細胞數(shù)據(jù)使用Flowjo 10 軟件分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌BL21/ pET20b（+）-cgt 的構(gòu)建與表達

將來源于B. xiaoxiensisSTB08 的cgt基因插入質(zhì)粒pET-20b（+）中，在宿主菌E. coliBL21 中成功分泌表達， 得到基因工程菌E. coliBL21（DE3）/pET20b（+）-cgt，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)得到粗酶液。

2.2 重組β-CGT 酶的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

在TB 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上， 經(jīng)過對溫度、 發(fā)酵時間、pH、碳源、氮源等進行優(yōu)化后，最終以玉米漿膏24 g/L、大豆蛋白胨6 g/L、葡萄糖2 g/L、麥芽糖4 g/L，KH2PO42.32 g/L、K2HPO4·3H2O 16.43 g/L 作為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃，pH 7.0 條件下發(fā)酵96 h 后胞外酶活達到34.66 U/mL， 接著對能夠顯著影響β-CGT 酶發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵條件（溶氧、鈣離子）進一步優(yōu)化，并對其影響機理進行分析。

2.2.1 溶氧對重組β-CGT 酶搖瓶發(fā)酵的影響在搖瓶發(fā)酵階段，溶氧的改變主要是通過控制搖瓶中的裝液量變化。 基于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果，選取不同的裝液量 （30、50、70、100、120、150 mL），接種體積分數(shù)為4%， 每隔12 h 取樣測定菌體濃度OD600以及重組大腸桿菌的胞外酶活力，并對發(fā)酵結(jié)束后的胞外β-CGT 酶以及不溶性包涵體進行SDSPAGE 分析，探究不同的溶氧對重組β-CGT 酶搖瓶發(fā)酵的影響。

如圖1 所示，當裝液量較少（30、50 mL）即發(fā)酵液中的溶氧含量較高時， 由于其傳氧系數(shù)較高，重組大腸桿菌迅速生長，菌體濃度增長很快，其OD600最高，但在此條件下重組大腸桿菌的產(chǎn)酶水平卻是最低的，推測可能是由于重組大腸桿菌的生長速度過快導(dǎo)致其形成了較多的不溶性包涵體，同時菌體生長速度過快也會導(dǎo)致代謝物的大量積累，影響發(fā)酵體系的pH 以及酶的穩(wěn)定性等從而抑制菌體產(chǎn)酶，并且由于裝液量較少，在發(fā)酵過程中也會增加發(fā)酵液的揮發(fā)，發(fā)酵過程中發(fā)酵液體積減少過多不利于菌體進行產(chǎn)物合成；裝液量過多（150 mL）會使發(fā)酵液中的溶氧含量過低，無法滿足菌體正常生長及代謝的需要，在此條件下菌體濃度過低，同時重組大腸桿菌的產(chǎn)酶水平也較低； 而當裝液量為70、100、120 mL 時，重組大腸桿菌的菌體濃度OD600處于較為適宜的水平，對應(yīng)的產(chǎn)酶水平也較高，因此在能夠維持重組大腸桿菌正常生長的情況下，盡可能避免其菌體快速生長是提高產(chǎn)酶水平的關(guān)鍵。 同樣，鄒純等發(fā)現(xiàn)在短小芽孢桿菌發(fā)酵中，盡可能避免其快速生長是提高產(chǎn)酶的關(guān)鍵[17]。 綜合考慮重組大腸桿菌的生長繁殖以及產(chǎn)酶情況，選取菌體濃度適當且產(chǎn)酶水平較高的裝液量100 mL 作為最優(yōu)裝液量，發(fā)酵96 h 后其胞外酶活達到66.86 U/mL。

圖1 溶氧對重組大腸桿菌生長和產(chǎn)β-CGT 酶的影響Fig. 1 Effects of dissolved oxygen on the growth and β-CGTase production of recombinant E. coli

對重組大腸桿菌的包涵體以及發(fā)酵結(jié)束的粗酶液進行SDS-PAGE 分析，如圖2 所示，分泌至胞外的酶量較多， 這可能是由于在不同的溶氧條件下，細胞外膜透性較大。 隨著發(fā)酵液中的溶氧增大，重組大腸桿菌形成的不溶性包涵體越多。 這是由于在較高的溶氧條件下，發(fā)酵前期重組大腸桿菌菌體濃度迅速增加，合成了較多的目標蛋白質(zhì)，同時，轉(zhuǎn)錄、翻譯以及折疊蛋白質(zhì)的速度過快，導(dǎo)致大量目標蛋白質(zhì)無法正確折疊而形成包涵體[18]，而包涵體的大量存在會嚴重堵塞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運通道，因此選擇適宜的裝液量（100 mL）對其生長及產(chǎn)酶至關(guān)重要。 同時可以看出， 在最優(yōu)裝液量條件下胞外酶條帶最粗，說明在此條件下重組大腸桿菌分泌到胞外的酶量最多，這與酶活測定結(jié)果一致。

圖2 不同溶氧下胞外酶和不溶性包涵體的SDS-PAGE 分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of extracellular enzyme and insoluble inclusion bodies under different dissolved oxygen levels

由上述結(jié)果可知，溶氧對于重組大腸桿菌的細胞影響較顯著， 故進一步利用流式細胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）對在不同溶氧條件下發(fā)酵結(jié)束的重組大腸桿菌菌體進行分析。 cFDA（羧基二乙酸熒光素）是二乙酸熒光素的一種衍生物，當細胞膜完整時，其水解的熒光素就會逐漸在細胞內(nèi)積累，常被用作細胞活性的標簽，而PI（碘化丙啶）無法透過完好的細胞膜進入細胞， 只有當細胞死亡或凋亡后，它才能夠進入細胞[19]，作者采用cFDA-PI 雙重熒光染色法來表征溶氧對重組大腸桿菌細胞的影響。 如圖3 所示，左上區(qū)域（Q1）表示PI 標記的死細胞，Q2區(qū)為PI 與cFDA 同時標記的已受損但仍然存活的細胞，Q3 區(qū)為cFDA 標記的活體細胞，Q4 區(qū)為細胞碎片。

圖3 不同溶氧下重組大腸桿菌的FCM 分析Fig. 3 FCM analysis of recombinant E. coli under different dissolved oxygen levels

當發(fā)酵液中的溶氧量過高時（裝液量30 mL），雖然菌體濃度高，即菌體數(shù)量較多，但Q1 區(qū)的細胞數(shù)目為72.5%，說明過高的溶氧會導(dǎo)致細胞嚴重受損，使細胞失去維持細胞穩(wěn)態(tài)和代謝物的功能，導(dǎo)致大部分細菌機械性壞死；當發(fā)酵液中的溶氧量有所降低時 （50~120 mL），Q3 區(qū)即活細胞數(shù)目顯著增加，同時Q2 區(qū)的細胞數(shù)目也顯著增加， 這說明適當降低溶氧能夠使得細胞活性增大。 在最優(yōu)溶氧條件下（即裝液量為100 mL），Q3 區(qū)的活細胞數(shù)目最多，即能夠用來分泌產(chǎn)酶的活細胞數(shù)目最多，故而其產(chǎn)酶情況最好；而當溶氧過低（裝液量為150 mL）時，不足以滿足細菌正常生長的需求，故選取最適宜的溶氧對于細胞活性以及生長產(chǎn)酶的影響至關(guān)重要。

2.2.2 金屬離子對重組β-CGT 酶搖瓶發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中的金屬離子主要由各種無機鹽提供，無機鹽類所提供的金屬離子對于細胞生長以及產(chǎn)物合成有著重要的影響，能夠影響細胞物質(zhì)的組成以及能量代謝，同時，金屬離子作為酶的輔基，還可以作為一些關(guān)鍵酶的輔助因子。 作者在發(fā)酵培養(yǎng)基（50 mL） 中分別添加終濃度為5 mmol/L 的Ca2+、Ba2+、Fe3+、Mg2+、K+、Cu2+，以不添加金屬離子的培養(yǎng)基作為對照，探究各種金屬離子對重組大腸桿菌產(chǎn)酶的影響。如圖4 所示，添加Ca2+以及Mg2+對于重組大腸桿菌產(chǎn)酶有促進作用，同樣，李才明等發(fā)現(xiàn)添加Ca2+能明顯激活酶的活力[20]，與本研究結(jié)果一致。 隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液的pH 隨之增大，不利于重組大腸桿菌生長及產(chǎn)酶，而Ca2+能沉淀磷酸鹽，并且可以與磷酸鹽和蛋白質(zhì)相互作用提供相對較低的pH 環(huán)境， 因此有利于其產(chǎn)酶，Ca2+的添加還具有其他的作用， 如Ca2+的滲透調(diào)節(jié)作用使得一些營養(yǎng)物質(zhì)易于進入細胞內(nèi)部[21]，同時推測其能夠增大細胞膜的通透性。 由于添加Ca2+對于促進重組大腸桿菌胞外產(chǎn)酶作用最為顯著，故最終在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定終濃度的Ca2+以提高酶活， 進一步對其濃度進行優(yōu)化， 發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度為25 mmol/L 的Ca2+，胞外酶活達到最高。

為了探究鈣離子是否能夠增大重組大腸桿菌細胞的通透性，對添加鈣離子以及對照組的細胞外膜的透性測定分析，并對發(fā)酵結(jié)束后的包涵體進行SDS-PAGE 分析。 如圖5 所示，熒光值的大小（熒光相對強度） 可以用來評價E. coli細胞外膜透性大小，添加一定濃度的鈣離子后，重組大腸桿菌的細胞外膜透性顯著增大，說明添加一定濃度的鈣離子可以增大其細胞外膜的透性，故重組β-CGT 酶更容易穿過細胞外膜分泌到胞外。 如圖6 所示，添加鈣離子相比于不添加鈣離子，重組大腸桿菌形成的不溶性包涵體較少，說明鈣離子有利于重組大腸桿菌減少包涵體的形成。 綜上，其分泌到胞外的可溶性酶較多。

圖6 不添加鈣離子及添加鈣離子時的不溶性包涵體的SDS-PAGE 分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of insoluble inclusion bodies without and with Ca2+addition

2.2.3 鈣離子協(xié)同溶氧對重組β-CGT 酶搖瓶發(fā)酵的影響搖瓶優(yōu)化發(fā)酵結(jié)果說明溶氧以及Ca2+的添加均對重組大腸桿菌胞外產(chǎn)酶均具有顯著影響，故進一步優(yōu)化添加Ca2+條件下的溶氧水平， 分別于30、50、70、100、120、150 mL 發(fā)酵液中添加終濃度為25 mmol/L 的Ca2+，如圖7 所示，在裝液量為30 mL時，添加終濃度為25 mmol/L 的Ca2+酶活最高，發(fā)酵96 h 后酶活為105.69 U/mL。 觀察其生長曲線可知，在30 mL 發(fā)酵液中添加Ca2+其菌體濃度遠高于其他組，而其對應(yīng)的胞外產(chǎn)酶量也是最高的。 這是因為在保證菌體生長濃度較高的同時，Ca2+增加細胞的通透性同時保護細胞，并促使細胞及時將CGT 酶分泌至胞外，故推測Ca2+以及溶氧對于重組β-CGT 酶的搖瓶發(fā)酵具有協(xié)同促進作用。

圖7 鈣離子協(xié)同溶氧對重組大腸桿菌生長和產(chǎn)β-CGT 酶的影響Fig. 7 Effects of Ca2+coordinated dissolved oxygen on the growth and β-CGTase production of recombinant E. coli

有文獻報道鈣離子對于細菌細胞有強大的保護作用[22]，為了驗證Ca2+對于重組大腸桿菌細胞是否具有保護作用，作者采用流式細胞術(shù)并用cFDAPI 雙重熒光染色法來探究Ca2+對重組大腸桿菌細胞的影響。 如圖8 所示，在溶氧較高（30 mL）發(fā)酵液中添加Ca2+后可以看出活細胞數(shù)目顯著增加。 當發(fā)酵液中的溶氧較高時， 細菌生長較快且OD600較高，但同時菌體生長過快，代謝物積累就會過多，導(dǎo)致其細胞損傷較大，壞死細胞較多，而添加Ca2+后，發(fā)現(xiàn)Q1 區(qū)的機械性壞死細胞數(shù)目顯著較少，同時Q3區(qū)的活細胞數(shù)目顯著增多， 故可以確定Ca2+對于細胞有一定的保護作用。

圖8 鈣離子協(xié)同溶氧對重組大腸桿菌影響的FCM 分析Fig. 8 FCM analysis of the effect of Ca2+coordinated dissolved oxygen on recombinant E. coli

3 結(jié) 語

實現(xiàn)了來源于B. xiaoxiensisSTB08 的β-CGT基因在大腸桿菌中的克隆與表達， 發(fā)現(xiàn)溶氧以及Ca2+對于重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有協(xié)同作用，即在較高的溶氧條件下添加Ca2+， 重組大腸桿菌的胞外酶活水平達到最高。 機理分析表明，較高的溶氧能夠保證菌體較高的生長濃度，但在此條件下機械性壞死的細胞過多， 而Ca2+的添加很好地保護了細胞，使得活細胞數(shù)目增加，同時Ca2+的添加減少了包涵體的形成，并使得細胞的通透性增大，促使細胞及時將CGT 酶分泌至胞外。可為相關(guān)酶的發(fā)酵優(yōu)化提供新的參考。