半理性設計提高甲酸脫氫酶（CbFDH）活力及熱穩定性

倪晗朦， 胡孟凱， 張恒維， 張 顯， 潘學瑋， 饒志明， 周楠迪

（江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122）

NAD+依 賴 型 甲 酸 脫 氫 酶 （ formate dehydrogenase，FDH，EC 1.2.1.2） 屬于D-2-羥基酸脫氫酶超家族[1]，是脫氫酶合成光學活性化合物中NADH 再生酶之一[2]，常見于甲基營養型微生物，例如可利用甲醇的一些酵母及其他真菌、細菌等[3-7]。甲酸脫氫酶可以將甲酸鹽底物的醛基或羰基氧化成CO2，并利用NAD+作為輔因子接受和轉移氫從而產生大量NADH[8]，故而該酶常被用于不對稱合成手性化合物過程中NADH 的原位再生[9-10]。 早在1995 年，甲酸脫氫酶就已經被用于偶聯亮氨酸脫氫酶以實現L-叔亮氨酸的工業化生產[11]，還被用于多種非天然氨基酸、手性醇及各種衍生物[12-13]。 相比于葡萄糖脫氫酶和亞磷酸脫氫酶等介導的輔酶再生體系，甲酸脫氫酶的共反應產物CO2更容易從體系中分離出來， 并且不會引起反應體系pH 的劇烈變化，大大降低了生產過程中使用酸堿的成本。 然而野生型的甲酸脫氫酶具有穩定性差、 酶活低等缺點， 往往會造成反應體系中輔酶NADH 供應不足，進而使產品轉化效率降低。 因此提高甲酸脫氫酶的穩定性和增強其對NAD+/NADH 輔酶再生的催化能力成為當下一大研究熱點。

隨著基因工程技術日漸成熟，多種不同來源的甲酸脫氫酶在大腸桿菌中被克隆表達[14]，其中博伊丁假絲酵母 （Candida boidinii） 來源的甲酸脫氫酶研究最為廣泛。 定向進化技術是甲酸脫氫酶改造的常用手段之一，通過構建序列多樣的突變文庫并從中篩選出符合預期效果的突變體。 盡管高通量篩選甲酸脫氫酶的方法已有報道[15-16]，但正向突變體的篩選過程仍非常復雜且耗時。 近年來，隨著蛋白質工程技術的迅速發展，越來越多的蛋白質三維結構被精確解析[17-18]。 研究者們針對甲酸脫氫酶輔酶特性、酶活力和穩定性等方面進行分子改造，大量關鍵氨基酸殘基被挖掘以提高FDH 性能[19-20]。 作者前期基于CbFDH 二級結構計算預測， 構建了A10C、I239C 突變株， 通過引入半胱氨酸殘基形成二硫鍵大大提高了CbFDH 的熱穩定性[21]。 Bulut 等對博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶的Phe285、Gln287和His311 位保守氨基酸殘基進行定點突變，驗證了其作為熱穩定性改造靶點的研究潛力[22]。 Q197 和P68 位氨基酸殘基被認為是影響甲酸脫氫酶輔酶再生能力的重要位點。 隨著蛋白質理性設計研究的深入，大量基于生物信息學和人工智能算法的蛋白質預測工具被用于探索蛋白質結構和氨基酸殘基特性對酶的影響[23]。例如，Sumbalova 等設計出HotSpot Wizard web 服務器（http：//loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/），其主要功能是針對活性位點和底物通道中的具有改造潛能的氨基酸殘基，計算預測誘變“熱點”，之后對“熱點”進行飽和突變和性能篩選，以達到提高蛋白質的穩定性、催化活性、底物特異性和對映體選擇性的目的[24]。

作者首先將博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶（CbFDH） 在大腸桿菌中異源表達， 然后利用HOTSPOT WIZARD v3.1 （https：//loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard）對CbFDH 氨基酸序列建模預測， 以期通過半理性設計優化CbFDH 的酶活及其熱穩定性。經篩選，P68G、Q197K 突變株比酶活較野生型分別提高11%和33%，但突變體熱穩定性明顯降低，因此結合前期工作進一步引入二硫鍵以提高突變體熱穩定性， 最終獲得一株熱穩定性顯著提高，比酶活較野生型提高31%、較I239C 提高45%的突變株CbFDH Q197K/I239C。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒與試劑

選用大腸桿菌Escherichia coliBL21 （DE3） 作為表達宿主， 表達Candida boidinii來源的FDH 基因Cbfdh（GenBank 登錄號：AJ 011046.2）， 含有Cbfdh的pUC19-Cbfdh質粒由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，并根據大腸桿菌表達宿主的密碼子偏好性進行密碼子優化。 pET-28a 購自Novagen 公司，帶有卡那霉素抗性基因。 本實驗所用酶制劑均購自諾唯贊公司 （中國南京）；Bradford 蛋白質濃度試劑盒及卡那霉素：購自生工（上海）生物工程有限公司；質粒快速提取試劑盒：購自Generay 公司；胰蛋白胨、酵母提取物及瓊脂粉：購自OXOID（英國）；其他試劑購自國藥集團（中國上海）。

1.2 研究方法

1.2.1 重組表達載體構建以pUC19-Cbfdh為模板利用Cbfdh-F/Cbfdh-R 引物PCR 擴增獲得Cbfdh基因，以pET-28a 為模板利用28a-F/28a-R 引物反向PCR 擴增獲得線性化載體。基因片段與線性化載體通過同源重組方式連接， 導入大腸桿菌E. coliBL21 中， 構建重組大腸桿菌BL21/pET28a-Cbfdh。以pET28a-Cbfdh為模板，設計點突變引物，通過反向PCR 引入突變點，構建一系列突變體。 帶有突變基因的重組質粒送金唯智公司測序，基因比對完全正確后標記保藏。 本研究所用引物如表1 所示。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組酶的表達及純化重組菌經平板活化，挑單克隆接種于含有50 mg/L 卡那抗生素的10 mL液態Luria-Bertani（LB）培養基中，37 ℃、200 r/min培養10 h。按接種體積分數1%轉接至50 mL LB 培養基中，37 ℃、200 r/min 繼續培養2 h，加入終濃度為0.8 mmol/L 的IPTG，16 ℃、180 r/min 誘導10 h。然后4 ℃、8 000 r/min 離心10 min 收集菌體， 細胞洗滌2 次后懸浮于0.05 mol/L PBS 緩沖液（pH 7.5）中，使用超聲波破碎儀進行細胞破碎。 細胞破碎液10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，去除沉淀，上清液即為粗酶液。

蛋白質純化方法使用鎳柱親和層析法[19]，粗酶液經0.22 μm 濾膜過濾后上樣至His GraviTrap 柱，用M0 緩沖液 （0.02 mol/L Tris、0.5 mol/L NaCl，pH為7.40±0.05） 進行柱平衡， 然后用M300 緩沖液（0.02 mol/L Tris、0.5 mol/L NaCl、0.5 mol/L 咪唑，pH為7.40±0.05）進行梯度洗脫，洗脫梯度為20%、80%和100%。純蛋白通過SDS-PAGE 凝膠電泳鑒定分析。

1.2.3 酶活及蛋白質濃度測定甲酸脫氫酶酶活測定采用紫外分光光度法， 反應溶液由0.05 mol/L PBS 緩沖液（pH 7.5）配制，包括167 mmol/L 甲酸鈉和1.67 mmol/L NAD+溶液。 取1.48 mL 甲酸鈉溶液置于石英比色皿， 依次加入80 μL NAD+溶液，10 μL 適當稀釋后的純酶液， 在30 ℃條件下啟動反應并計時， 每30 s 記錄OD340變化值。 根據不同濃度NADH 的OD340繪制標準曲線計算每分鐘產生的NADH 量。 甲酸脫氫酶酶活力單位定義：每分鐘消耗或生成1 μmol NADH 所需要的酶量。 蛋白質質量濃度測定使用Bradford 蛋白質測定試劑盒。

1.2.4 酶學性質分析最適反應溫度測定： 用pH 7.5、0.5 mol/L 的PBS 緩沖液將純酶稀釋到適合濃度后加入到預熱好的反應體系中反應， 按1.4 中方法計算比酶活，反應溫度梯度設置為25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃。 初始酶活為100%，計算不同溫度下突變體酶的相對比酶活。

最適反應pH 測定：將突變體純酶用不同pH 緩沖液稀釋到適合濃度后加入至預熱好的相應pH 體系中反應，使用的緩沖液如下：磷酸氫二鈉-檸檬酸鹽緩沖液（pH 3.0~6.0），磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液 （pH 6.0~9.0）， 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 9.0~12.0），緩沖液濃度均為20 mmol/L。 反應溫度為最適溫度。按初始比酶活為100%計算不同pH 下純酶的相對比酶活。

熱穩定性測定：將稀釋后的純酶分別在溫度梯度為30、40、50、52、54、56、58、60、62、64、70 ℃的金屬浴中保溫20 min 后在最適反應條件下進行酶活測定， 以保溫前最適反應溫度下比酶活為100%計算相對比酶活，繪制相對酶活曲線。

pH 穩定性測定：用不同pH 的緩沖液將純酶液分別稀釋至相同倍數后，35 ℃孵育1 h 后取樣測酶活，繪制相對酶活曲線。

1.2.5 突變點預測CbFDH 的三維結構模型文件（PDB ID：5dn9） 從RCSB 數據庫獲得。 利用HOTSPOT WIZARD v3.1 （https：//loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard） 中的 FUNCTIONAL HOT SPOTS （對活性中心及底物通道附近高度可變殘基的熱點預測）和STABILITY HOT SPOTS（柔性殘基對應的穩定性熱點預測）兩大功能板塊對模型進行預測。

1.2.6 三維建模及結構分析利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）以CbFDH 三維結構模型文件（PDB ID：5dn9）為模板進行同源建模，利用PYMOL 軟件對突變后蛋白質模型進行結構分析和圖形制作。

2 結果與分析

2.1 突變點選擇

利用HOTSPOT WIZARD v3.1 對CbFDH 的三維結構進行預測。 軟件根據內置的Rosetta 和FoldX套件對蛋白質模板的熱力學穩定性進行計算，在預測突變點的同時提供可靠的可供替換的氨基酸殘基。 同時，根據2 個具有改造潛能的氨基酸殘基位點，即P68 和Q197 用軟件對其進行突變方案預測，最終選擇預測突變位點P68G、Q197K、Y196K、V120S、A172V、G117V、A229S 進一步研究。

2.2 重組載體的構建表達及純化

為實現大腸桿菌中CbFDH 的異源表達， 從攜帶Cbfdh基因的pUC19-Cbfdh質粒上擴增出Cbfdh基因片段，與線性質粒pET28a 連接并化轉入E. coliBL21 中， 構建重組大腸桿菌BL21/pET28a-Cbfdh。SDS-PAGE 蛋白質凝膠電泳結果顯示（見圖1（a）），BL21/pET28a-Cbfdh重組菌的細胞破碎液上清和沉淀中均出現3.5×104~4.5×104明顯加粗條帶，與CbFDH 理論相對分子質量40 000 相符， 這表明CbFDH 在大腸桿菌中成功表達。

圖1 甲酸脫氫酶表達及純化情況SDS-PAGE 分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of FDHs expression and purification

為進一步探究CbFDH 的酶學性質， 將CbFDH和突變體酶分別進行了鎳柱純化。 純酶SDS-PAGE分析如圖1 （b） 所示。 條帶1 為野生型BL21/pET28a-Cbfdh重組菌株細胞破碎上清液，純化后純酶蛋白質條帶在40 000 左右，與理論蛋白質相對分子質量基本相符，突變體酶相對分子質量無明顯變化。

2.3 酶活測定

將純突變體酶用0.5 mol/L PBS 緩沖液（pH 7.5）作適當稀釋，根據1.4 中方法測定酶活和蛋白質質量濃度， 計算比酶活。 如圖2 所示，P68G 和Q197K 為正向突變體， 酶活分別為6.92 U/mg 和8.27 U/mg， 較野生型CbFDH 分別提高了11%和33%，其余突變體酶活均有明顯下降。 其中，A229S突變體純化后在SDS-PAGE 電泳分析中顯示出單一且完整的條帶， 但是以NAD+和甲酸鈉為底物和輔底物進行酶活檢測時沒有活性。

圖2 突變體比酶活Fig. 2 Enzyme specific activity of mutants

2.4 酶學性質分析

根據1.2.4 中方法對不同突變體酶的酶學性質進行分析，結果如圖3 所示。 由于G117V 和A172V突變體酶活過低導致測量誤差過大，其酶學性質數據未展示。

圖3 突變體酶學性質Fig. 3 Enzymatic properties of mutants

突變體酶的最適溫度如圖3（a）所示，當溫度為25~55 ℃時，野生型CbFDH 的酶活隨著溫度升高而不斷增高；當溫度為55 ℃時酶活最高；當溫度高于55 ℃酶活不斷降低。 因此CbFDH 最適溫度為55 ℃，這一結果與戚云龍等結果一致[25]。 Y196K 和Q197K 突變體的最適溫度分別降低為45、50 ℃，V120S 突變體上升至60 ℃， 其余突變體明顯變化。如圖3（b）所示突變體酶的熱穩定性較親本CbFDH均變差， 且隨溫度的升高而加快，55 ℃保溫20 min后親本酶活可保留近60%，而Q197K 僅殘余50%，其余突變體酶活殘余不足40%。

各突變體酶最適pH 如圖3（c）所示，突變體與親本CbFDH 最適pH 均為7。pH 穩定性測試如圖3（d） 所示， 突變酶pH 穩定性相比于親本無明顯損失。 當pH＜6.0 時，突變體酶活快速下降，但在pH 5孵育1 h 后酶活仍可保留50%以上， 說明突變體酶的耐酸性較好；當pH 在6~10 時，親本和各突變體殘余酶活均保留80%以上，說明突變體酶具有良好的pH 穩定性及強耐堿性。

2.5 結構分析

P68G 突變的氨基酸殘基位于NAD+的底物結合口袋內，圖4（a）、（b）、（c）可以看出，由于P68G 的突變使得原本位于氨基酸殘基側鏈的苯環被氫取代，這一變化減少了氨基酸殘基側鏈上苯環對甲酸鹽底物分子進入結合口袋時的空間位阻，提高了活性中心和底物分子間的親和力。 此外，P68G 突變后酶活的升高也可能是因為甘氨酸取代后該位點的疏水性增強， 有助于活性中心與NAD+的結合。Q197K 突變點的氨基酸殘基側鏈由酰胺基變為直鏈胺丁基，圖4（d）和圖4（e）顯示197 位氨基酸殘基位于底物結合口袋入口的一段環狀無規則卷曲的loop 環上，這一突變增強了肽鏈的擺動性和酶的柔性，使得酶分子在反應中更易捕獲相對分子質量較大的NAD+進入口袋，從而提高了突變體的酶活。

圖4 單突變體酶蛋白三維結構Fig. 4 Three-dimensional structure of mutants

2.6 突變體穩定性優化

雖然P68G 和Q197K 突變體表現出比野生型CbFDH 更高的催化活性，但其熱穩定性較野生型明顯降低。 為進一步提高突變體酶的熱穩定性，基于研究室前期工作[21]，引入I239C 突變構建了P68G/I239C、Q197K/I239C 2 個組合突變株。 組合突變體酶均表現出比野生型更高的熱穩定性（見圖5），在60 ℃野生型CbFDH 和2 個單突變體迅速失活，而P68G/I239C 和Q197K/I239C 的熱穩定性明顯提高，3 min 時相對酶活仍可保持60%以上。

圖5 組合突變體酶活Fig. 5 Enzymatic activity of combined mutants

圖6 組合突變體酶熱穩定性Fig. 6 Thermal stability of combined mutants

盡管組合突變體熱穩定性都顯著增強，但其中Q197K/I239C 的比酶活較野生型CbFDH 提高了31%，較I239C 提高了45%，為8.15 U/mg；而P68G/I239C 酶活相對野生型CbFDH 提高了6%， 相較于單點突變株酶活提升有所下降。 為了解釋這一現象，分析組合體酶蛋白的三維結構，如圖7 所示。 野生型CbFDH 序列中僅包含C23 和C262 兩個半胱氨酸殘基， 其中C262 位于I239 位氨基酸殘基附近，氨基酸殘基I239 和C262 位于羅斯曼折疊基序的一段無規則卷曲中。 在突變體酶中構建二硫鍵I239C-C262， 降低了酶分子蛋白質結構的柔性，導致對NAD+親和力減弱。 因此，組合體在穩定性提高的同時較單突變體的酶活有所降低，但同時一定程度上固定了活性中心與催化相關的氨基酸殘基。

圖7 組合突變體酶蛋白三維結構Fig. 7 Three-dimensional structure of combined mutants

3 結 語

作者為了獲得性能優良的甲酸脫氫酶，首先在大腸桿菌中異源表達博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶CbFDH，然后用HOTSPOT WIZARD v3.1 對CbFDH 進行模擬計算并構建了一系列突變體，測定其酶活并進行酶學性質分析，篩選出2 個酶活較高的突變體P68G、Q197K， 酶活分別較野生型提高了11%和33%。 這是因為P68G 突變后該位點氨基酸殘基疏水性加強， 提高了底物口袋與NAD+的親和力， 殘基側鏈對甲酸鹽底物的空間位阻減小；而Q197K 增強了loop 環的擺動性和酶的柔性使得NAD+更容易進入底物口袋。然而，P68G、Q197K 這2點突變使酶的熱穩定性降低，因此引入已報道能形成二硫鍵使FDH 熱穩定性增強的I239C 突變，構建了P68G/I239C、Q197K/I239C 這2 個突變株。 經酶學性質測定，Q197K/I239C 突變體不僅保留了野生型CbFDH 較高的催化活性， 其熱穩定性也得到了顯著提高。 通過半理性設計對甲酸脫氫酶結構進行模擬、計算和預測以提高其酶活及熱穩定性，簡化了酶篩選的工作量，為今后甲酸脫氫酶及其他相關酶的改造提供了更高效的策略。