血清外泌體中GP1BA 的表達水平與動脈粥樣硬化的相關性分析

張洪欽 江 裕 陳子凌 何文慧 鄭伯仁

福州市第二醫院藥劑科（福建福州 350007）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是世界上最常見的死亡原因之一，患病率為萬分之二。AS主要由低密度脂蛋白膽固醇升高引起，其主要癥狀是內皮損傷、平滑肌細胞過度增殖和淋巴細胞浸潤導致的內膜增生［1］，使管腔變窄并減少流向靶組織的血流量［2］。外泌體在細胞間通信中非常有效，因為它們能夠以保護性方式傳輸可生物降解的分子。新出現的證據表明，不同細胞分泌的旁分泌外泌體通過其蛋白質和非編碼RNA成分在AS中起著至關重要的作用，這可能成為AS的治療方法［3］。最近研究發現，心肌梗死后受損心肌細胞釋放高表達糖蛋白 Ib 血小板亞基α（glycoprotein Ib platelet subunit alpha，GP1BA）的外泌體，觸發了血管生成。GP1BA是GPIb-Ⅸ-V復合物最重要的亞基，充當內皮細胞損傷及功能障礙標志物血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和凝血酶受體，通過與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等信號途徑相互作用，誘導血小板黏附和活化，加速血栓形成［5］。敲除GPIBA基因則能減輕小鼠AS。GPIBA被認為是血栓治療靶點之一，并研發了相關抗血小板制劑。既往對免疫細胞、干細胞外泌體調節和治療心血管疾病進行了大量研究［4］。但是，外泌體攜帶及運輸GP1BA對AS的調節作用尚不清楚。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經本院倫理委員會批準（倫理批件號：2021023），納入本院2022年1月—2023年1月收治的選取30例心電圖提示ST-T改變及冠狀動脈造影顯示有AS斑塊的患者為動脈粥樣硬化組，其中男19例、女11例，年齡（65.3±10.8）歲。入選標準：①有完整、詳實病例資料，如出入院記錄及所需檢查資料等：②具有血脂基線數據資料；③年齡≥18歲。排除標準：①肝功能不全；②入院前1個月發生過心肌梗死，心功能分級大于Ⅲ級者；③患有腎病綜合征或慢性腎臟病≥4期；④患有甲狀腺功能亢進或減退；⑤感染性疾病急性期；⑥惡性腫瘤、結核等全身消耗性疾病；⑦可引起脂質代謝異常的疾病，如庫欣病等；⑧長期采用糖皮質激素治療者。收集同期體檢無上述異常的志愿者30例為對照組，其中男19名、女11名，年齡（59.0±13.8）歲。對照組納入標準：無心腦血管疾病史且臨床三大常規檢查均正常。排除標準：有精神意識障礙、不愿配合本研究或意識交流等困難者。2組一般資料比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究均經患者或家屬同意并自愿簽署知情同意書。

1.2 外泌體提取與鑒定

收集血清樣本，500×g離心10 min后，用0.22 μm無菌過濾器過濾細胞碎片和大囊泡；轉移至裝有超濾膜的超濾儀，氮氣加壓過濾；100 000×g離心40 min，收集沉淀。透射電鏡觀察外泌體形態：外泌體置于pH 7.4的2%甲醛+ 1.5%戊二醛磷酸鈉，4 ℃固定2 h，蛋白質印跡雜交膜清洗液（Tris-buffered saline，TBS）漂洗；1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀固定2.5 h，TBS漂洗。梯度乙醇脫水，環氧樹脂包埋，半薄切片定位，超薄切片。3%醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，電鏡觀察。外泌體粒徑分析：ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體濃度粒徑，ZetaView 8.04.02 SP2軟件獲取外泌體粒徑直徑及濃度。蛋白質提取，加入載樣緩沖液，95 ℃水浴加熱5 min；雙吡啶甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量；上樣，SDSPAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，4 ℃孵育一抗（標志蛋白跨膜四蛋白-29（the cluster of differentiation 9，tetraspanin-29，CD9）、跨膜四蛋白-28（the cluster of differentiation 81，tetraspanin-28，CD81）、鈣連接蛋白（Calnexin）和腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene101，TSG101）（均購于北京索萊寶科技有限公司），稀釋倍數均為1∶1 000），過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，化學發光成像，凝膠圖像分析。

1.3 實時熒光定量（real time quantitative，RTqPCR）

樣本中加入NucleoZol提取總RNA，cDNA合成，PCR擴增，GAPDH為內參基因，根據2-ΔΔCt法分析GP1BA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 蛋白免疫印跡

提取樣本中的外泌體后，BCA法定量；上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝膠電泳，轉膜，封閉，4 ℃孵育一抗（β-actin，購于艾博抗（上海）貿易有限公司）］，1∶1 000，GP1BA （購于北京索萊寶科技有限公司），1∶500）過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，化學發光成像，凝膠圖像分析。

1.5 酶聯免疫吸附試驗

根據試劑盒（均購于武漢博士德生物工程有限公司）說明書操作，繪制標準曲線后，檢測血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、高敏肌鈣蛋白（high sensitivity cardiac troponin T，hs-cTnT）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）水平。

1.6 統計學分析

實驗數據采用SPSS 20.0統計軟件分析，正態性分布的計量數據以（）表示。數據，組間比較采用t檢驗；不符合正態性分布，采用非參數檢驗。計數資料采用χ2檢驗和Pearson分析相關性。P＜0.05表示為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 外泌體提取與鑒定

納入30例動脈粥樣硬化患者為動脈粥樣硬化組和30例健康者為對照組。電鏡結果和粒徑檢測結果顯示，血清外泌體平均粒徑大小在100 nm，符合外泌體質量標準（圖1A、B）。蛋白免疫印跡檢測標志蛋白CD9、CD81和TSG101結果顯示均檢測到外泌體標志蛋白，Calnexin為外泌體陰性標志蛋白，均檢測不到，表明外泌體提取成功（圖1C）。

圖1 外泌體鑒定

2.2 外泌體中GP1BA表達量檢測

根據RT-qPCR結果可得在動脈粥樣硬化組中的GP1BA的表達量高于對照組（圖2A，P＜0.05），蛋白免疫印跡結果表明動脈粥樣硬化組中的GP1BA的蛋白水平高于對照組（圖2B，P＜0.05）。

圖2 外泌體GP1BA 表達量檢測

2.3 血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hscTnT、vWF含量檢測

通過ELISA法檢測2組受試者血清中的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ及血管和心肌損傷標志物hs-cTnT、vWF含量發現，動脈粥樣硬化組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及血管和心肌損傷標志物hs-cTnT、vWF含量均高于對照組（圖3，P＜0.05）。

圖3 ELisa 檢測血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hs-cTnT、vWF 含量

2.4 GP1BA與血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hs-cTnT、vWF的相關性

對外泌體中的G P 1 B A 的表達量與血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hs-cTnT、vWF的相關性發現，GP1BA與TNF-α（r=0.632）、IL-1β（r=0.549）、IFN-γ（r=0.572）、hs-cTnT（r=0.533）、vWF（r=0.597）均存在相關性（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 GP1BA 與TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hs-cTnT、vWF 含量的相關性分析

3 討 論

動脈粥樣硬化涉及動脈壁中纖維脂肪病變或斑塊的形成。動脈粥樣硬化的病理過程包括內皮損傷、脂質沉積、炎性細胞浸潤、泡沫細胞形成和斑塊形成。本研究收集動脈粥樣硬化患者與健康志愿者檢測炎癥因子發現動脈粥樣硬化患者血清中的炎癥因子水平升高。有研究表明在動脈粥樣硬化發生中，動脈內膜中的脂質積聚是炎癥性動脈粥樣硬化病變形成的根本原因。同時，血管和心肌損傷標志物hs-cTnT、vWF也升高，表明動脈粥樣硬化患者的血管和心肌受到脅迫。而在動脈粥樣硬化部位的脆弱斑塊破裂導致原位血栓形成和壁內出血，導致缺血和中風［6］。這與hscTnT、vWF表達量升高與動脈粥樣硬化可造成血管損傷的結論相吻合。

細胞通信對于幾乎所有生理和病理過程都是必不可少的，包括動脈粥樣硬化。除了廣泛接受的神經傳遞和內分泌信號傳導外，細胞外囊泡還被認為是細胞間通信的新參與者［7］，分為外泌體、凋亡體、微囊泡和其他囊泡。外泌體（直徑40~160 nm）［8］由幾乎所有細胞類型分泌，并攜帶生物分子，如DNA、RNA、蛋白質、脂質和代謝物。我們提取的外泌體從電鏡結果看出是雙層膜結構，且直徑約為70 nm，大小形態均符合外泌體特征，鑒定為外泌體。外泌體在跨越生物屏障方面也顯示出巨大的優勢，并參與短距離和長距離的細胞間通訊［9］。因此，外泌體作為診斷和治療應用的生物標志物和藥物載體已被深入研究。在梗死后外泌體蛋白質組中富集的功能，包括蛋白質代謝，蛋白酶抑制劑活性，細胞骨架蛋白結合和細胞通信、生長、維持，以及血小板脫顆粒、止血和血液凝固的途徑。先前研究已經表明，血小板是梗死心肌內最早積累的炎癥細胞群之一［10］，在心肌梗死血漿外泌體中，發現GP1BA蛋白含量升高9.18倍，而在本研究中，動脈粥樣硬化組的血清外泌體中的GP1BA含量也高于對照組，這可能與血管損傷相關。GP1BA能與vWF和纖維蛋白原有效結合，形成復合物并參與血小板聚集，動脈粥樣硬化與血小板、巨噬細胞以及這些細胞釋放的物質（包括生長因子）之間的相互作用有關。動脈粥樣硬化預防的方法也包括：保護內皮，特別是與維持其非血栓形成特征有關：抑制血小板相互作用［11］。通過相關性分析，我們結果也表明二者呈正相關，且相關性較強。血小板還可以釋放促炎介質并形成促進動脈粥樣硬化的血小板-白細胞復合物［12-13］，研究結果TNF-α、IL-1β、IFN-γ炎癥因子顯著升高與前人研究結果相似。由此猜測，TNF-α、IL-1β、IFN-γ炎癥因子增多促進GP1BA與vWF形成復合體，加快動脈粥樣硬化進程。

綜上所述，血清外泌體中的GP1BA的表達水平與動脈粥樣硬化存在相關性，可作為動脈粥樣硬化的潛在標志物。