決明子水提物對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用研究

閆志芳，任可樂，孟祥龍，李秀英

（山西中醫藥大學 中藥與食品工程學院，中藥炮制山西省重點實驗室，山西 晉中 030619）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是肝臟相關疾病和肝病死亡的主要原因之一[1]。ALD早期表現為急性酒精性損傷，主要原因是短時間內飲用的大量酒精。肝細胞在人體消化吸收代謝酒精時，產生大量的氧自由基和多種炎性介質，這些物質使肝臟的氧化還原反應無法進行，導致脂質過氧化，損害細胞膜，細胞器的功能受到限制，肝臟受到損傷[2]。現代醫學治療ALD需長期服用的保肝藥物會產生一定的耐藥性、藥源性疾病等不良反應。

決明子為豆科植物鈍葉決明Cassia btusifoliaL.或決明（小決明）Cassia toraL.的干燥成熟種子，具有清熱明目，潤腸通便的作用。研究發現，決明子富含多種化學活性物質，主要包括蒽醌類、脂肪酸類、黃酮類、多糖類、苷類等[3]，具有保肝[4]、降血壓[5]、降脂[6]、降糖[7]、抗氧化[8]等藥理作用。其中，水溶性物質蒽醌類等被證實通過改善轉氨酶水平、抗炎、調節Nrf2介導的ERK/MAPK/JNK等信號通路等，緩解酒精引起的急性肝損傷[9-13]。

為研究決明子緩解酒精所致肝損傷，本文通過灌胃白酒建立小鼠急性酒精性肝損傷模型[14]，經決明子水提物給藥后檢測小鼠血清及肝臟組織中生化指標與血清炎性因子的變化，觀察肝臟病理組織病變程度，以明確決明子水提物對于肝臟的保護作用，并探討初步的作用機制，旨在為決明子進一步開發與利用提供實驗基礎與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

決明子（北京同仁堂，產地安徽，批號：220216004），經山西中醫藥大學張朔生教授鑒定為豆科植物鈍葉決明Cassia obtusifoliaL.或決明（小決明）Cassia toraL.的干燥成熟種子。白酒（42°，北京紅星）；水飛薊素（批號：C10742879，麥克林）；通用型組織固定液（批號：G1101，Servicebio）；油紅染液、蘇木素染液、分化液、返藍液、甘油明膠封片劑（Servicebio）；異丙醇（批號：80109218，國藥集團）。

甘油三酯（TG，批號：20210819）、總膽固醇（TC，批號：20210530）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT，批號：20200815）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST，批號：20210726）、丙二醛（MDA，批號：20200921）、谷胱甘肽（GSH，批號：20209717）（南京建成生物工程研究所）；腫瘤壞死因子（TNF-α，批號：202109），白介素1β（IL-1β，批號：202107）、白介素6（IL-6，批號：202106）（上海酶免生物）；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

TGL-20B高速冷凍離心機（中國上海安亭科學儀器廠）；AX224ZH/E十萬分之一電子天平（奧豪斯上海）；KZ-III-FP高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾）；SynergyHTX多功能酶標儀（美國伯騰）；RE-2000B旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；CRYOSTAR NX50冰凍切片機（Thermo）；LEICA 819切片刀（ 上海徠卡）；黏附載玻片（冰凍切片，白漆色帶，G6012-2，Servicebio）。

1.3 實驗動物

SPF級ICR小鼠，雄性，體重15～25 g，許可證號：SCXK（京）2019-0011，合格證號：110324210102969025[斯貝福（北京）]。倫理批準號：AWE202209002（動物實驗經山西中醫藥大學醫學倫理委員會批準）。實驗期間動物飼養于溫度25 ℃，濕度40 %～70 %的清潔級動物房。

1.4 方法

1.4.1 決明子水提物的制備 稱取決明子200 g，加8倍量的水，浸泡1 h，再加熱回流提取2次，每次30 min，將提取液混合濃縮至200 ml（相當于生藥1 g/ml），備用。

1.4.2 動物分組、造模及給藥 參照文獻方法[15]，將60只小鼠適應性飼養一周，按體質量高低，隨機分為空白組、模型組、陽性組、決明子水提物低、中、高劑量組（2.25，4.5，9 g/kg）（依據2020年版《中國藥典》，通過人臨床劑量換算成小鼠等效劑量，按照折合后劑量的3，9，18倍換算而得），每組10只。空白組與模型組灌胃等體積蒸餾水，陽性組灌胃水飛薊素（0.2 g/kg），其余各給藥組按照相應劑量灌胃給藥，連續給藥7 d。末次給藥9 h后，除空白組外其余各組均按照體質量12 ml/kg一次性灌胃白酒（10 ml/kg），建立急性酒精性肝損傷模型。

1.4.3 血液和組織樣本采集 最后一次給藥結束后，乙醚麻醉，摘眼球取血，室溫靜置30 min，于3000 r/min離心15 min，得待測血清，放置于-80 ℃冰箱。分離取肝臟并稱重，部分肝臟固定于組織固定液中，其余肝臟置于-80 ℃冰箱。

1.4.4 體重變化及臟器指數 記錄60只小鼠體質量每日的變化，計算小鼠日平均增重；解剖取新鮮肝臟，利用生理鹽水清洗干凈肝臟，置于濾紙上吸干水分后，稱重，計算肝臟的臟器指數。計算按式1、式2。

1.4.5 肝臟組織油紅O染色 取肝臟組織同一部位的組織做冰凍切片，經生理鹽水清洗后，用4 %多聚甲醛溶液固定，冰凍切片，晾干，油紅染液浸染6～8 min。將切片停留3 s后依次浸入60 %異丙醇分化2次，各3 s和5 s，再依次浸入純水中浸洗2次，各10 s。取出切片，停留3 s后浸入蘇木素復染3～5 min，純水浸洗3次，各5，10，30 s。分化液（以 60 %酒精為溶劑）分化2～8 s，蒸餾水洗2次各10 s，返藍液返藍1 s，將切片輕輕浸入自來水中浸洗2次，各5 s和10 s，甘油明膠封片。在顯微鏡下觀察肝臟組織的形態學，并采集圖片[10]。

1.4.6 生化指標檢測 參照試劑盒說明，檢測小鼠血清中TG、TC、ALT、AST、MDA含量以及肝臟組織中GSH的含量。

1.4.7 炎性因子水平的測定 采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.4.8 統計學方法 用GraphPadPrism 8.0.2統計軟件進行t檢驗，以均數±方差（±s）表示為數據資料，組間比較以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 對急性酒精性肝損傷小鼠體重及肝臟指數的影響

與空白組相比，模型組體質量顯著降低，肝臟指數顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。體重降低表明酒精性肝損傷可能引起某些病理變化，引起小鼠食欲下降致體重增長減慢；肝臟指數顯著升高說明一次性大量飲酒使得肝臟受損，導致肝臟腫大。與模型組比較，陽性藥和決明子水提物高劑量組小鼠體質量增長明顯，且能顯著降低肝臟指數（P＜0.05或P＜0.01），結果呈劑量依賴關系。表明決明子水提物可降低小鼠的肝臟指數，緩解酒精造成的肝臟腫脹問題（見圖1）。

圖1 決明子水提物對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數、小鼠體質量的影響（±s，n=10）

2.2 對急性酒精性肝損傷的小鼠肝臟病理影響

肝臟組織油紅O染色結果見圖2。由圖2可見，空白組小鼠肝組織未見脂肪顆粒堆積。模型組與空白組對比肝細胞體積增大，出現大量的不同程度的紅色脂滴聚集。與模型組相比，決明子水提物各組的脂滴聚集減少。結果表明，決明子水提物能減少急性酒精性肝損傷的小鼠體內脂質的累積。

圖2 決明子水提物對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟的病理變化的影響（×200）

2.3 對急性酒精性肝損傷小鼠血清TG、TC含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠TG、TC水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組相比，決明子水提物各劑量組TG、TC含量均有下降趨勢，陽性藥組與決明子水提物中、高劑量組TG、TC含量呈顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）（見圖3）。表明決明子水提物能有效降低急性酒精性肝損傷血清中的TC、TG水平，對急性酒精性肝損傷有一定的改善作用。

圖3 決明子水提物對急性酒精性肝損傷小鼠TG、TC含量的影響（±s，n=10）

2.4 對急性酒精性肝損傷小鼠血清氨基轉移酶水平ALT、AST含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠ALT、AST兩種氨基轉移酶水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥組與決明子水提物各劑量組ALT含量均明顯下降（P＜0.01），且呈劑量依賴性；陽性藥組與決明子水提物中、高劑量組AST含量均明顯下降（P＜0.01）（見圖4）。結果表明，決明子水提物能顯著降低氨基酸轉移酶的水平。

圖4 決明子水提物對急性酒精性肝損傷小鼠AST、ALT含量的影響（±s，n=10）

2.5 對急性酒精肝損傷小鼠血清GSH含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠GSH含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥組與決明子水提物中、高劑量組GSH含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）（見圖5）。結果表明，決明子水提物可提高機體抗氧化酶的活性，消除酒精代謝過程中產生過多自由基及其他損害物質，從而減輕肝臟受損狀況。

圖5 決明子水提物對急性酒精性肝損傷小鼠GSH含量的影響（±s，n=10）

2.6 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠MDA水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組相比，各劑量組均有不同程度的降低趨勢，陽性藥組與決明子水提物高劑量組MDA水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）（見圖6）。結果表明，決明子水提物可減緩代謝酒精過程中脂質過氧化反應，對急性酒精性肝損傷有一定的保護作用。

圖6 決明子水提物對急性酒精性肝損傷小鼠MDA含量的影響（±s，n=10）

2.7 對急性酒精性肝損傷小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

與空白組相比，模型組顯著高于正常組（P＜0.01），表明酒精代謝過程中可導致小鼠肝細胞發生炎性損傷；與模型組相比，陽性藥組與決明子水提物高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）（見圖7）。結果表明，決明子水提物可抑制炎性因子水平，發揮其肝保護作用。

綜上，決明子水提物對酒精引起的酒精性肝損傷有一定的保護作用，其作用機制可能與改善肝細胞代謝紊亂、降低脂質代謝、提高機體抗氧化酶活性、抑制促炎細胞因子表達有關[16-26]。本研究為進一步開發決明子水提物保肝等功能性產品提供理論基礎，下一步將探究決明子緩解急性酒精性肝損傷的通路和靶點。