烏雞白鳳片對大鼠胚胎-胎仔發育的毒性研究

孫 超，王玉晶，朱立欣，黃艷麗，湯連升

（1. 山東省藥學科學院 新藥評價中心，山東 濟南 250101；2. 津藥達仁堂集團股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津 300012）

烏雞白鳳片起源于中藥經典名方，屬于對傳統名方的二次劑型升級，具有補氣養血、調經止帶功效，本品用于氣血兩虛、身體瘦弱、腰膝酸軟、月經不調、帶下[1]。中藥因其成分復雜，給不良反應監控帶來諸多困難[2]。成年女性是烏雞白鳳片的常用人群，但關于烏雞白鳳片對于妊娠期女性胚胎及胎仔發育的影響鮮有報道，故開展其臨床前胚胎及胎仔發育的評價尤為重要。本文在GLP條件下，利用SPF級SD大鼠為實驗動物，經妊娠期間重復給藥，對SD大鼠進行胚胎-胎仔發育毒性的評價研究，為該藥的臨床應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠（維通利華實驗動物技術有限公司），飼養于山東省藥學科學院新藥評價中心SPF級動物房，環境溫度 20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，濕度 40 %～70 %，動物自由飲食飲水。本實驗遵循實驗動物使用的3R原則，對動物給予人道主義關懷。

1.2 受試物和主要儀器

烏雞白鳳片（津藥達仁堂集團股份有限公司樂仁堂制藥廠，批號：ZSWB210601）。

UW2200H電子天平（日本島津）；TXB622L電子天平（日本島津）；UlitiMate 3000高效液相色譜儀（Thermo）；LED數顯加熱型磁力攪拌器（BIOLOGIX）；游標卡尺（哈爾濱量具刃具集團）。

1.3 試驗方法

1.3.1 劑量設計 根據藥物非臨床安全性研究技術指導原則及相關文獻確定試驗劑量[3-6]。烏雞白鳳片臨床用法用量為每天給藥2次，一次2片，每片0.5 g[1]。按照成人平均體重70 kg折算用量為28.6 mg/(kg·d)，大鼠的等效臨床用量約為180 mg/(kg·d)。烏雞白鳳片最大可行性給藥濃度為500 mg/ml，大鼠重復灌胃給藥可接受最大體積為20 ml/kg。故本試驗供試品設計低、中、高劑量組給藥劑量分別為2.5，5.0和10.0 g/(kg·d)，分別約為人用臨床劑量的87.4，174.8和349.7倍，大鼠等效臨床劑量的13.9，27.8和55.6倍。同時設溶媒對照組（純水）作為對照。

1.3.2 動物分組 將檢疫合格的雌鼠與雄鼠l:l合籠交配，合籠后次日觀察陰道栓脫落情況，發現陰道栓者確認為妊娠0天（GD0）[7]，將GD0雌鼠分組，未見陰道栓者繼續交配，以每天確認受孕動物為基數采用普通拉丁法進行分組。

1.3.3 給藥方法 將烏雞白鳳片粉碎至細粉后純水攪拌混勻至所需濃度，采用HPLC法測定配制后制劑內芍藥苷含量[8-9]。模擬臨床給藥途徑采用經口灌胃進行給藥，每天給藥1次，給藥周期為GD6～GD17，供試品組給藥制劑在給藥前置常溫持續攪拌至混懸均勻，給藥過程中持續攪拌。

1.3.4 指標檢查[10]孕鼠檢查：試驗期間，所有孕鼠每天進行臨床觀察，定期進行體重和攝食量檢測。孕鼠于GD20解剖觀察，測定卵巢和子宮窩重，剖開子宮，暴露著床痕，依據著床痕的位置按照從右側子宮角到左側子宮角的順序，以阿拉伯數字依次標記活胎，并標記吸收胎及死胎位置，計數黃體數、活胎數、死胎數、吸收胎數和著床數。

胎仔檢查：活胎仔判斷性別，測定體長、尾長和體重，進行外觀檢查。每窩取約半數活胎胎仔制作內臟標本；每窩剩余半數活胎胎仔制備成骨骼標本；對標本進行內臟和骨骼檢查。

1.3.5 統計指標[11]孕鼠體重、攝食量、子宮（窩重）、卵巢濕重、胎仔窩平均體重、窩平均身長、窩平均尾長、黃體數、胎仔數（著床數）等數據采用單因素方差法進行統計分析。活胎率、死胎率、吸收胎率、外觀畸形率、內臟畸形率、骨骼畸變率、骨骼變異率等指標采用χ2檢驗。所有檢驗結果以雙側檢驗顯著性為準。

2 結果與分析

2.1 孕鼠檢查

試驗期間，各組孕鼠一般狀態良好，未見由于給藥引起的異常癥狀。試驗期間，給藥各組妊娠動物體重與溶媒對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。給藥組動物部分時期攝食量較溶媒對照組小幅降低，但體重均未見影響，認為其主要原因為給藥體積較大和給藥制劑黏稠引起胃容量減少，導致的攝食量減少，屬于非毒性因素。剖檢各組孕鼠肉眼均未見明顯臟器組織的異常。供試品各給藥劑量組妊娠鼠子宮（窩重）和卵巢臟器濕重與溶媒對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1～3。

表1 烏雞白鳳片對孕鼠體重指標的影響/g

表2 烏雞白鳳片對孕鼠攝食量指標的影響/g

表3 烏雞白鳳片對孕鼠生殖器官濕重的影響/g

供試品各組孕鼠黃體數及胎仔數（著床數）與溶媒對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。供試品各給藥劑量組活胎率和死胎率與溶媒對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），供試品中、高劑量組動物吸收胎率與溶媒對照組比較降低，差異有統計學意義（P＜0.05），吸收胎率降低對生殖發育是有益的，提示SD大鼠妊娠期間給予供試品可能具有一定的保胎作用，其作用體機制待進一步研究。詳見表4。

表4 孕鼠生殖功能指標統計結果

2.2 胎仔檢查

供試品各給藥組胎仔體重、身長和尾長與溶媒對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表5。

表5 胎仔發育和胎仔外觀檢查指標統計結果

溶媒對照組和供試品低、中劑量組胎仔外觀檢查均發現個別胎仔身體局部血腫或水腫現象，供試品高劑量組胎仔外觀檢查均未見異常。由于上述外觀異常散在分布且出現的部位各不先相同，且無劑量相關性，判斷為剖宮取胎仔過程中使用工器具物理損傷造成，與供試品無關。詳見表5。

溶媒對照組胎仔內臟檢查未見異常，供試品高劑量組有1例胎仔為小型大腦，其它均未見異常，供試品高劑量組胎仔內臟畸形率與溶媒對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），且畸形率很低，考慮為自發性畸形，故未進行供試品低、中劑量組胎仔的內臟畸形檢查，提示妊娠大鼠連續給予供試品未見對胎仔內臟發育各檢查指標的影響。詳見表6。

表6 胎仔內臟和骨骼檢查統計結果

溶媒對照組和供試品高劑量組胎仔骨骼檢查主要異常為骨化不全和未骨化。骨化不全發生部位主要是顱骨背部上枕骨和胸骨，供試品高劑量組骨化不全變異率與溶媒對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），溶媒對照組和供試品高劑量組未骨化出現窩數分別為19/22，16/21，散在分布于各檢查窩。未骨化發生部位主要為胸骨，供試品高劑量組未骨化畸形率與溶媒對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），溶媒對照組和供試品高劑量組未骨化出現窩數分別為15/22，12/21，散在分布于各檢查窩。骨骼變異的骨化不全及畸形的未骨化異常，均可隨胎仔出生后逐步恢復。提示妊娠大鼠連續給予供試品未見對胎仔骨骼發育各檢查指標的影響。詳見表6。

3 結論

本試驗條件下，妊娠鼠于GD6～GD17日經口灌胃給予10 g/(kg·d)及以下劑量的烏雞白鳳片，對妊娠SD大鼠母體和胚胎未見毒性影響，胎仔發育正常，無致畸作用，妊娠SD大鼠母體NOAEL和胎仔NOAEL均為10 g/(kg·d)。烏雞白鳳片用于成年女性主要治療子宮出血、月經不調、乳腺增生、高催乳素等癥狀[12-15]，對于妊娠期婦女，本品臨床使用安全范圍較大，安全窗較寬，是否有明顯胎兒致畸風險還需更多臨床驗證。