一株適用于苦蕎米發酵的紅曲霉菌株分離與篩選

張艷艷，孫曉康，張曉元，張林軍，袁丹丹，劉英梅，陳 勉，張秀華，劉 飛

（山東省藥學科學院，山東省生物藥物重點實驗室，山東省多糖類藥物工程實驗室，多糖類藥物發酵與精制國家地方聯合工程實驗室，山東 濟南 250101）

中國是苦蕎麥生產大國，面積和產量均居世界第二位，出口量居第一位。苦蕎麥中富含多種營養成分，具有保健功能，是一種“藥食兩用”產品[1]。據《本草綱目》記載，苦蕎麥具有益氣、利目、健胃等功效。苦蕎麥富含蘆丁等黃酮類化合物[2]，藥理學研究表明，苦蕎麥的初級加工品苦蕎米具有降糖降脂、抗氧化、預防心腦血管系統疾病等作用[3-5]，是一種頗具開發潛力的功能性食品[6]。

紅曲霉屬于真菌門，是紅曲科腐生絲狀真菌，種類豐富[7]，廣泛用于傳統食品加工過程。紅曲色素是安全的天然色素[8]，廣泛用于食品著色。研究表明，紅曲霉代謝產物有非常重要的生理活性[9]，如洛伐他汀有降低膽固醇和降血脂的功效[10-12]；γ-氨基丁酸有降血壓的作用[13-14]。然而紅曲霉的產物桔青霉素[18]是對人畜有害的一種真菌毒素[19]，毒性主要作用于腎臟[20]，還有誘發突變、致畸、導致腫瘤等潛在危險[21-23]。不同紅曲霉產桔青霉素的能力各不相同[24]，因此高產洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低產桔青霉素成為篩選紅曲霉菌株重要指標。

苦蕎米產品深層次、細化的開發研究較少，本研究結合苦蕎米的天然屬性和紅曲霉的代謝產物特性，以總黃酮、紅曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸和桔青霉素的產量為綜合考察指標，篩選合適的發酵菌株，旨在進一步深化苦蕎米開發。

1 材料與儀器

1.1 材料

豆腐乳、紅曲米、苦蕎米（市售）；洛伐他汀、γ-氨基丁酸對照品（分析純，阿拉丁）；蘆丁對照品（分析純，純度：98 %，北京百靈威科技）；孟加拉紅固體培養基（青島海博）；鄰苯二醛、巰基乙醇、磷酸（分析純，國藥集團）、乙腈、甲醇（色譜純，德國默克公司）；AlCl3（分析純、天津科密歐）；玻璃纖維濾紙、桔青霉素標準品，桔青霉素免疫親和柱（Pribolab、青島普瑞邦生物）。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-M20A紫外檢測器、RF-20A熒光檢測器（日本島津）；Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；U-T6紫外可見分光光度計（屹譜儀器）；Legend micro 21R低溫高速離心機（美國Thermo）；BSA1245電子天平（德國賽多利斯）；KQ-600E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；GM-0.33A隔膜真空泵（天津津騰）；S201K pH計（瑞士梅特勒）；FXB101-3電熱恒溫鼓風干燥箱（上海樹立）。

2 方法

2.1 紅曲霉菌株分離純化、鑒定

取豆腐乳50 g、紅曲米50 g，分別置入200 ml無菌生理鹽水，漩渦震蕩，無菌條件下于孟加拉紅固體平板中劃線，28 ℃培養3 d，挑取少量菌絲接種于孟加拉紅固體平板中繼續恒溫培養7 d，繼續挑取少量菌絲轉接純化，直至得到純菌株，30 %甘油洗脫孢子置入-80 ℃冰箱保藏備用。樣品送濟南博尚生物技術有限公司進行ITS1基因序列測序，用于菌株鑒定。

2.2 紅曲霉發酵苦蕎米樣品制備

2.2.1 苦蕎米預處理 稱取苦蕎米500 g，加入1000 ml純凈水浸泡2 h，沖洗干凈后，瀝干水分，蒸煮1 h，加入0.5 %酵母粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，4 ℃冰箱保藏備用。

2.2.2 孢子懸液制備 將-80 ℃冰箱保藏的菌株于孟加拉紅固體平板中進行活化，培養7 d，用無菌生理鹽水洗脫孢子，轉入帶有無菌玻璃珠的三角瓶中，150 r/min震蕩30 min，打散孢子，采用4層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲后，利用血球計數板在光學顯微鏡下計數，調整孢子數量級約為106/ml，備用。

2.2.3 紅曲霉發酵 將1 ml孢子懸液接種于200 g苦蕎米固體發酵培養基中，28 ℃靜止發酵11 d。每間隔2 d混勻一次。

2.2.4 發酵樣品后處理 將發酵結束的固體發酵物置入烘箱，65 ℃烘干6～8 h至恒重，備用。

2.3 紅曲色價的測定方法

紅曲色價的測定參照GB1886.181-2016食品安全國家標準食品添加劑紅曲紅[25]的方法進行。稱取樣品5 g，沸水100 ml溶解，搖勻，靜止放涼后，混勻過濾。取此溶液置入1 cm比色皿，分光光度計505 nm測定其吸光度值（A）。色價計算：以試樣溶液濃度為1 %，1 cm比色皿，在505 nm波長處測的A計。

2.4 總黃酮的測定方法（AlCl3法[26]）

蘆丁標準溶液（1 mg/ml）制備：稱取蘆丁0.0255 g，采用70 %乙醇溶液溶解后，定容至25 ml，于4 ℃冰箱保藏備用。

標準曲線繪制：分別取0，0.050，0.075，0.100，0.125，0.150，0.200 ml蘆丁標準溶液，加入1.5 % AlCl3溶液2 ml，最終用70 %乙醇定容至10 ml，混勻后，室溫靜置30 min，于273 nm波長處測定A。以蘆丁標準溶液濃度為橫坐標，A為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。

樣品溶液的制備：稱取苦蕎麥和發酵后樣品各50 g，采用料理機粉碎，取粉碎后樣品1 g，加入70 %乙醇10 ml，溶解2 h，于273 nm波長處測定A。

2.5 洛伐他汀的測定方法

HPLC條件[27]：色譜柱 ZORBAX SB-Aq；流動相乙腈:0.01 %磷酸（V:V）=60:40；紫外檢測器；檢測波長：238 nm；流速1 ml/min；進樣量20 μl。

標準曲線繪制：稱取洛伐他汀對照品16 mg，溶于4 ml乙腈，逐步稀釋至濃度為0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/ml，0.22 μm濾膜過濾，HPLC進樣分析，以洛伐他汀濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制洛伐他汀標準曲線。

樣品溶液的制備：稱取樣品5.0 g，溶于25 ml乙腈，浸泡30 min，超聲20 min后，0.22 μm濾膜過濾，HPLC進樣分析。

2.6 γ-氨基丁酸的測定方法

HPLC條件[28]：色譜柱 ZORBAX C18；流動相：甲醇:1 %冰乙酸水（V:V）=60:40；紫外檢測器；檢測波長：332 nm；流速1 ml/min；進樣量20 μl。

柱前衍生化：衍生試劑[29]：稱取鄰苯二醛3 mg，溶于1 ml甲醇，加10 μl巰基乙醇，用0.4 mol/L（pH 10.2）硼酸緩沖溶液定容至10 ml。取0.2 ml待測樣品與0.1 ml衍生試劑，混勻反應1 min，0.22 μm濾膜過濾，HPLC進樣分析。

標準曲線繪制：稱取0.2 gγ-氨基丁酸溶于70 %甲醇中，定容至10 ml，逐步稀釋至濃度為0.003，0.005，0.01，0.02，0.04 mg/ml，0.22 μm濾膜過濾，經柱前衍生化后，HPLC進樣分析，以γ-氨基丁酸濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制γ-氨基丁酸標準曲線。

樣品溶液的制備：稱取樣品5 g，溶于25 ml，70 %甲醇超聲20 min，5000 r/min 離心5 min，經柱前衍生化后，0.22 μm濾膜過濾，HPLC進樣分析。

2.7 桔青霉素檢測的測定方法

參考國標GB5009.222-2016食品安全國家標準食品中桔青霉素的測定[30]，紅曲類產品中桔青霉素的測定方法。HPLC條件：色譜柱 ZORBAX C18；流動相：乙腈:0.1 %磷酸（V:V）=90:10；熒光檢測器；激發波長：350 nm，發射波長500 nm；流速0.8 ml/min；進樣量20 μl。

桔青霉素對照品溶液：取桔青霉素標準品（5 μg/ml）4 μl，溶于996 μl甲醇溶液，即得20 ng/ml桔青霉素對照品溶液，逐步稀釋得到濃度5，4，2，1，0.5 ng/ml桔青霉素對照品。

樣品溶液的制備：分別稱取苦蕎米及發酵樣品各1.0 g，加入20 ml，70 %甲醇提取液，超聲提取20 min，8000 r/min離心5 min，吸取上清1 ml加入49 ml 10 mmol/L磷酸溶液（pH 7.5）稀釋，采用纖維濾紙過濾，取10 ml過桔青霉素免疫親和柱，采用甲醇:10 mmol/L磷酸溶液（pH 2.5）洗脫，0.22 μm濾膜過濾，液相色譜檢測。

3 結果與分析

3.1 紅曲霉分離純化、鑒定

紅曲霉在孟加拉紅固體培養基生長會產生紅色素，基于此分離純化得到25株疑似菌株，經濟南博尚生物技術有限公司鑒定，22株為紅曲霉，優選長勢較快的5株菌株，編號為MZ1、MZ7、MZ18、MZ20和MZ23，此5株菌在孟加拉紅固體培養基上培養7 d（見圖1），其中MZ1、MZ7和MZ18紅曲霉菌絲體呈黃色，MZ20和MZ23的菌絲體猶如白色毛毯狀。成熟后均具有皺褶，呈紅色。針對5株菌的ITS1基因序列，采用軟件MEGA11.0進行序列比對，構建系統發育樹（見圖2），結果表明，各菌株均屬紅曲霉種。

圖1 5株紅曲霉菌株形態

圖2 基于ITS1基因序列建立的紅曲霉菌株系統發育樹

3.2 發酵后樣品色價分析

經MZ1、MZ7、MZ18、MZ20和MZ23紅曲霉菌株發酵苦蕎米的樣品，分別命名為MY1、MY7、MY18、MY20和MY23，其色價測定結果見圖3。結果表明，不同紅曲霉菌株發酵的苦蕎米樣品色價均有所不同，其中樣品MY20的顏色最深，色價最高，樣品濃度為1 %、1 cm比色皿，在505 nm波長處測得A為0.395±0.008。

圖3 各樣品色價

3.3 總黃酮測定結果

以蘆丁為對照品測定總黃酮的含量，測定蘆丁標準曲線為Y=0.0332X+0.001，R2=0.9998，蘆丁在0～25 μg/ml濃度范圍內與A呈良好的線性關系。以此方法測定苦蕎米及發酵后各樣品中總黃酮的含量，結果見圖4。苦蕎米的總黃酮含量為6.49±1.61 mg/g，發酵后樣品的總黃酮含量均有不同程度的提高，其中樣品MY20的總黃酮含量最高，可達29.03±4.39 mg/g，是發酵之前的4.47倍。

3.4 洛伐他汀測定結果

以洛伐他汀對照品測定的標準曲線為Y=27 910 846.6667X+16 856.9778，R2=0.9978，洛伐他汀在10～60 μg/ml濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。采用此方法測定苦蕎米及發酵后各樣品中洛伐他汀的含量，結果見圖5。苦蕎米中洛伐他汀含量為零，不同紅曲霉菌株發酵后的洛伐他汀含量相差較大，其中樣品MY20的洛伐他汀含量最高，可達0.52±0.04 μg/g。

圖5 樣品中洛伐他汀含量

3.5 γ-氨基丁酸測定結果

以γ-氨基丁酸對照品測定的標準曲線為Y=47 319 479.1394X-10 311.0746，R2=0.9997，γ-氨基丁酸在3～40 μg/ml濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。苦蕎米及發酵各樣品中的γ-氨基丁酸含量見圖6。苦蕎米中γ-氨基丁酸含量為41.06±6.58 μg/g，發酵后樣品γ-氨基丁酸含量均高于苦蕎米，MY7、MY20和MY23的γ-氨基丁酸含量分別為139.45±6.10，135.89±7.22，135.31±5.83 μg/g。

圖6 樣品中γ-氨基丁酸含量

3.6 桔青霉素測定結果

歐盟規定在紅曲霉發酵大米的食品補充劑中桔青霉素的最大限量值為 2.0 mg/kg[31]，日本規定在紅曲色素中桔青霉素的最大限量值 0.2 mg/kg[32]，食品安全國家標準GB 1886.181-2016對食品添加劑紅曲紅色素中的桔青霉素含量限定為40 μg/kg，輕工行業標準QB/T2847-2007對功能性紅曲米（粉）桔青霉素含量限定為50 μg/kg。

以桔青霉素對照品測定的標準曲線為Y=105 397X-7599.3，R2=0.9909，桔青霉素在0.5～5 ng/ml濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。苦蕎米及發酵各樣品中的桔青霉素含量見圖7。發酵后樣品的桔青霉素均不高于國家標準和輕工行業標準。

4 結論

本研究中通過分離純化鑒定，優選5株紅曲霉菌株，經發酵苦蕎米，檢測發酵后樣品的色價、總黃酮、洛伐他汀、γ-氨基丁酸和桔青霉素的含量，結果顯示紅曲霉菌株MZ20發酵樣品MY20的色價、總黃酮和洛伐他汀的含量最高，樣品MY7的γ-氨基丁酸含量最高，所有樣品桔青霉素含量均不高于40 μg/kg。綜合上述實驗結果選擇紅曲霉菌株MZ20作為苦蕎米的發酵菌株。后續的實驗計劃優化發酵條件提高色價、總黃酮、洛伐他汀、γ-氨基丁酸的含量，降低桔青霉素含量。