基于網絡藥理學和分子對接探討黃精抗衰老的作用機制

柯昌虎，嚴 慧，趙 陽，朱 軍，李志浩

（1.湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院，湖北十堰 442008；2.西安交通大學第二附屬醫院（西北醫院），西安 710004）

人口老齡化在全世界呈不可逆的趨勢，是人類正面臨的一個共同難題。目前，中國65 歲及以上人口比重達13.50%［1］，即將步入中度老齡化階段，人口老齡化程度已明顯高于世界平均水平（9.3%）。衰老是生物體的結構和功能隨著年齡的增長而下降的一種生理性現象，與炎癥反應、應激反應、能量代謝、內分泌等有關，已成為糖尿病、癌癥、心血管疾病等人類疾病的主要危險因素［2］。衰老問題是社會問題，也是重要的生物醫學問題。如何有效延緩衰老進程，提高健康整體水平，應對老齡化帶來的挑戰，成為當下人們思考和關注的熱點問題。中醫藥在預防保健方面優勢明顯，中藥及復方可以有效延緩衰老，干預老年性疾病發生發展過程［3］。

黃精（PolygonatiRhizoma）始載于《名醫別錄》，自古以來作為養生佳品，是一味藥食同源的藥材，廣泛用于臨床配方、中成藥生產以及古法九制后作為功能性食品及藥膳原料等。藥用黃精來源于百合科植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎的功效［4］。現代研究表明，黃精主要含有多糖類、皂苷類、黃酮類、生物堿類、植物甾醇類等化學成分［5］，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、抑菌抗炎、抗氧化、提高免疫力、抗骨質疏松等多方面的藥理作用［6］，臨床上用于治療動脈粥樣硬化、卵巢功能減退、糖尿病并發癥、原發性高血壓、慢性胃炎、改善心腎及肝腎功能等。研究發現，黃精可以通過調控BDNF-TrkB 信號途徑，顯著上調突觸可塑性相關蛋白的表達，改善自然衰老大鼠海馬和皮層神經元損傷，進而改善自然衰老大鼠認知功能障礙［7］；可以通過降低ROS水平來延緩傳代培養內皮祖細胞的衰老進程并保護其功能［8］；可以通過抑制ATM/ATR 通路，調節內皮祖細胞的細胞周期，干預內皮祖細胞的老化進程［9］。黃精中功能性成分多糖可以通過調節大鼠Klotho-FGF23內分泌軸、緩解氧化應激、平衡鈣磷代謝發揮抗衰老作用［10］；可以通過抑制氧化應激來減輕D-半乳糖誘導的心臟衰老［11］；可以清除自由基，增加抗氧化酶活性，能夠改善D-Gal模型小鼠學習記憶的能力［12］。雖然黃精具有良好的抗衰老作用，但其抗衰老的藥效物質成分尚無系統報道，發揮療效的具體機制亦不明確。本研究利用網絡藥理學和分子對接方法，構建黃精有效成分-靶點-衰老作用網絡，探討其抗衰老的物質基礎及可能的分子作用機制，為臨床治療衰老及保健產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 黃精活性成分及作用靶點的篩選

通過檢索TCMSP 數據庫收集黃精的化學成分，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18 兩個指標作為篩選條件獲取候選成分［13］，在PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取相關成分的SMILES 格式，未檢索到的化合物通過TCMSP 數據庫下載成分的mol2 格式文件，然后轉化為SMILES格式文件。通過Swiss target prediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）導入SMILES 文件獲取成分的靶點，取Probability 大于0 的靶點。

1.2 衰老疾病相關靶點的篩選及共同靶點的獲取

以“aging”為檢索詞，分別在GeneCards（https：//www. genecards. org/）、OMIM（https：//omim. org/）、DiGSeE（http：//210.107.182.61/geneSearch/）、HAGR（https：//genomics.senescence.info/）數據庫中篩選衰老相關靶點，其中GeneCards 數據庫中提取關聯性評分大于10 的基因。在Venny 2.1 在線平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分別錄入黃精與衰老的靶點，繪制韋恩圖，獲取二者的共有靶點。

1.3 藥物-成分-疾病-靶點網絡的構建

使用Cytoscape 3.8.2 軟件上傳成分及靶點信息，構建“藥物-成分-疾病-靶點”相互作用網絡圖，使用Network Analyzer 功能以節點度值（Degree）為拓撲指標進行分析。在網絡中，節點分別代表藥物、成分、靶點和疾病，邊表示任意兩者之間的互作關系。

1.4 蛋白互作網絡的構建

在STRING 在線平臺數據庫（https：//www.stringdb.org/）中，點擊Multiple proteins 上傳共有靶點，設置Organism 類型為“Homo sapiens”，選擇交互作用大于0.4 的靶點，下載TSV 格式數據文件，導入Cytoscape 3.8.2 軟件中進行拓撲分析，構建蛋白質相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網絡可視化。

1.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO 功能與KEGG 通路富集分析，主要由以下4步進行。第一步，上傳黃精的有效作用靶點；第二步，Select Identifier 設置為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，并限定物種為“Homo Sapiens”；第三步，List Type 設置為“Gene List”；第四步，提交數據獲取結果。以P＜0.01 為閾值進行篩選，探討黃精抗衰老的生物學過程和信號通路。

1.6 分子對接驗證

從PubChem 數據庫下載活性成分2D 結構的sdf文件，使用Open Babel 軟件將其轉化為mol2 格式。從PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）中獲得蛋白受體的3D 結構，運用PyMOL 軟件對蛋白去水、去除蛋白結構中小分子配體，保存pdb 文件格式。使用AutoDock 工具將蛋白和活性成分進行分子對接，再使用PyMOL 軟件對成分-蛋白對接結果進行可視化分析。結合自由能小于0，則表明藥物成分的分子和配體受體可以自發結合，結合打分值越低則形成的復合物越穩定。

2 結果與分析

2.1 黃精主要活性成分及作用靶點

檢索TCMSP 數據庫得到黃精的化學成分114個，以OB≥30%和DL≥0.18 作為指標共篩選出活性成分12 個，結果見表1。將各個成分的SMILES 格式導入Swiss target prediction 數據中查找成分靶點，取Probability 大于0，合并去重共得到318 個靶點。

續表1

2.2 疾病靶點的檢索及藥物-疾病共有靶點的篩選

使用GeneCards、OMIM、DiGSeE、HAGR 數據庫篩選衰老靶點，合并去重后共獲得506 個靶點。使用Venny 在線工具對黃精靶點和衰老靶點進行交集分析，繪制出韋恩圖，如圖1 所示，二者取匹配后得到黃精和衰老共有靶點81 個。

圖1 黃精和衰老的靶點韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

將黃精活性成分與共有靶點等信息輸入到Cytoscape 3.8.2 軟件中，繪制“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網絡，如圖2 所示。共有95 個節點、302條邊，圖中黃色六邊形代表黃精，綠色正方形代表中藥的核心成分，藍色圓形代表靶點，紅色菱形代表疾病。對網絡圖進行拓撲分析，degree平均值為6.357 9，其中degree 排名前5 位的成分是黃芩素（degree=31）、4′，5-二羥基黃酮（degree=30）、甘草素（degree=28）、（2R）-7-羥基-2-（4-羥基苯基）-苯并四氫吡喃-4-酮（degree=28）、zhonghualiaoine 1（degree=25），可能是黃精抗衰老的關鍵活性成分。

2.4 蛋白相互作用網絡構建

在STRING 數據庫中錄入黃精和衰老共有靶點，選取置信度＞0.4 的網絡數據，得到黃精抗衰老的靶點蛋白相互作用信息數據，導入Cytoscape 3.8.2 軟件中進行PPI可視化分析，網絡中共有81 個節點，共有910 條邊，degree 平均值為22.469 1，大于平均值靶點的有34 個，結果如圖3 所示。Degree 排名前5位的靶點是EGFR（degree=60）、VEGFA（degree=57）、HIF1A（degree=51）、ESR1（degree=51）、STAT3（degree=51），其可能在抗衰老中發揮重要調控作用。

2.5 GO 功能富集分析結果

利用DAVID 數據庫對篩選的基因進行GO 功能富集分析（P＜0.01），結果共有227 條生物學過程，其中生物過程（BP）164 條，主要涉及蛋白質自磷酸化、細胞增殖的正調控、基因表達的正調控、凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化等；細胞組分表達過程（CC）25 條，主要涉及核質、胞漿、受體復合物、小窩、線粒體等；分子功能相關的過程（MF）38 條，主要涉及酶結合、ATP 結合、蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、蛋白質結合等。分別選取BP、CC、MF 的前10 個條目進行氣泡圖展示，結果見圖4，其中橫軸為富集因子，縱軸為GO 功能名稱，表明黃精可以通過參與調控多種生物學過程而發揮抗衰老作用。

圖4 黃精抗衰老的GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析結果

對篩選的基因進行KEGG 通路富集分析（P＜0.01），共獲得79 條信號通路，主要涉及癌癥途徑（30個靶點）、癌癥中的蛋白多糖（21 個靶點）、HIF-1 信號通路（15 個靶點）、Ras 信號通路（20 個靶點）、癌癥的中樞碳代謝（13 個靶點）、PI3K-Akt 信號通路（23個靶點）、FoxO 信號通路（16 個靶點）、Rap1 信號通路（18 個靶點）、催乳素信號通路（12 個靶點）、ErbB信號通路（12 個靶點）、胰島素信號通路（14 個靶點）等。選擇前20 條進行氣泡圖展示，結果如圖5 所示，其中橫軸為富集因子，縱軸為通路名稱，表明黃精的有效成分和抗衰老靶點可能分布于不同的通路中，可通過多種通路達到抗衰老的作用。

圖5 黃精抗衰老的KEGG 通路富集分析

2.7 分子對接結果

從PDB 數據庫中篩選受體EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 的蛋白三維結構，將其分別與配體黃芩素（C4）、4′，5 -二羥基黃酮（C1）、甘草素（C2）、（2R）-7-羥基-2-（4-羥基苯基）-苯并四氫吡喃-4-酮（C3）、zhonghualiaoine 1（C11）在AutoDock中進行分子對接，結合能小于-20.93 kJ/mol 表示可以形成穩定的對接結構［14］，5 個活性成分與5 個靶點之間均能產生穩定的結合，對接結合能見圖6。受體ESR1 與配體的結合能均小于-20.93 kJ/mol，使用PyMOL 軟件進行可視化分析，結果顯示，ESR1 與C4通過氨基酸殘基ALA318、ASP321、ARG363 產生6個氫鍵作用，與C1 通過氨基酸殘基GLY521、LEU387 產生2 個氫鍵作用，與C2 通過氨基酸殘基GLU353、ARG394 產生2 個氫鍵作用，與C3 通過氨基酸殘基GLY521 產生1 個氫鍵作用，與C11 通過氨基酸殘基HIS305 產生3 個氫鍵作用（圖7）。

圖6 對接結合能熱圖

圖7 分子對接圖

3 小結與討論

衰老是生理功能不可逆轉地逐漸衰退，表現出抵抗感染的能力下降、對疫苗的反應減弱、癌癥發病率增加、自身免疫和結構性低度炎癥的發病率升高等，會引起各種癌癥、心血管疾病、代謝性疾病等諸多與年齡相關的疾病，從而給家庭和整個社會帶來了沉重的心理和經濟負擔［15］。因此，尋找抗衰老藥物對延緩生理性衰老和治療衰老相關疾病都至關重要。中醫藥干預衰老以整體觀念、辨證論治為特點，在延緩衰老方面作用明顯。《抱樸子》中記載黃精“得坤土之氣，獲天地之精”，被美譽為“仙人余糧”，《本草綱目》稱黃精“補諸虛、填精髓，平補氣血而潤”。黃精對肺、脾、腎都能補益，藥用食用均可以防衰延年。現代藥理研究也表明黃精具有良好的延緩衰老等藥理作用，但其化學成分復雜，治療衰老分子機制尚未明確，本研究采用網絡藥理學對黃精治療衰老的機制進行分析，并利用分子對接技術進行驗證。

以生物利用度和類藥性為考察指標，從黃精中篩選出黃芩素、4′，5-二羥基黃酮、甘草素、（2R）-7-羥基-2-（4-羥基苯基）-苯并四氫吡喃-4-酮、zhonghualiaoine 1 等活性成分。其中，黃芩素屬于黃酮類活性成分，能夠有效清除自由基，起到抗氧化劑作用，并應用于治療與氧化應激相關的多種疾病，可以通過降低果蠅體內活性氧、丙二醛、氧化型谷胱甘肽等3 種物質的含量，減輕氧化應激水平，從而延長果蠅壽命［16］；可以通過調控氨基酸代謝、核苷酸代謝和糖代謝等途徑延緩大鼠衰老［17］；可以提高衰老大鼠心肌抗氧化能力，抑制其下游p53/p21Cip1/Waf1信號通路，延緩成年SD 大鼠的心肌衰老［18］；可以顯著抑制SAMP8 小鼠大腦皮層中IL-6、IL-1β、TNF-α 等促炎細胞因子的釋放，明顯改變6 個菌屬的豐度，通過抑制皮層促炎細胞因子和調節腸道菌群，改善小鼠的衰老狀態和認知功能［19］；可以通過抑制SASP，抑制JAK2/STAT1/NF-κB 通路和調節亮氨酸代謝，在H2O2誘導的衰老星形膠質細胞中發揮保護和抗衰老作用［20］。甘草素屬于雙氫黃酮類成分，具有抗炎、抗氧化以及神經保護作用，能夠改善學習記憶功能，有助于延緩衰老。生物體內自由基過量累積會加速機體老化，甘草素可以通過抽氫反應捕獲體內·OH、·OOH 和·OOCl3C 3 種活性氧自由基，發揮清除自由基作用［21］。甘草素還具有雌激素樣作用，通過上調ERβ 水平，對抗Aβ 毒副作用，可以消除去卵巢APP/PS1 雙轉基因小鼠腦內老年斑［22］。

經黃精和衰老共有靶點交集篩選出EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 等靶點。其中表皮生長因子（EGF）是EGFR 最重要的配體之一，影響細胞的增殖、分化等過程，以EGF 激活EGFR 能夠誘導細胞衰老［23］。血管內皮生長因子（VEGF）參與血管生成，在控制血管通透性、維持心血管活性及微血管密度等方面發揮重要的作用。通過基因手段保持循環中的VEGF 水平能夠維持衰老過程中的血管穩態，提供全面的衰老保護，減輕各種年齡相關疾病，例如年齡相關的體重增加、肝脂肪變性、骨質疏松、炎癥和腫瘤。提升小鼠體內VEGF 水平，能夠顯著延長小鼠壽命，雄性小鼠延壽48%、雌性小鼠延壽39%［24］。缺氧誘導因子1A（HIF1A/HIF1α）信號在急性缺氧應激中，對維持細胞存活具有非常重要的意義。長期慢性的缺氧以及病理性應激條件下，HIF-1α 信號會通過誘導組蛋白賴氨酸去甲基化酶來破壞染色質的穩定性，從而引起細胞衰老和組織纖維化。同時，細胞衰老提供的炎性微環境又會進一步刺激HIF-1α 誘導的組蛋白賴氨酸去甲基化酶的表達，從而陷入一個惡性循環［25］。雌激素受體α（ESRα）參與衰老過程中的生物過程，有助于維持心血管、代謝、認知、下丘腦和邊緣功能等生物功能，ERα 基因（ESR1）的DNA 甲基化變化在調節ERα 水平中起直接作用，老年女性E2 水平下降與ESR1 基因CpGI 低甲基化的降低有關［26］。信號轉導與轉錄激活子3（STAT3）作為JAK/STATs 通路的重要成員，廣泛參與免疫調節、衰老等過程。研究發現，STAT3通路及自噬激活參與血管緊張素II誘導的小鼠腎小管上皮細胞衰老過程，氯沙坦作用可抑制STAT3 的激活、抑制自噬過度激活并延緩小鼠腎小管上皮細胞衰老［27］。

經GO 功能分析獲取蛋白質自磷酸化、細胞增殖的正調控、基因表達的正調控等生物學過程。經KEGG 通路分析獲取癌癥途徑、癌癥中的蛋白多糖、HIF-1、Ras、癌癥的中樞碳代謝、PI3K-Akt、FoxO、Rap1 等信號通路。其中，HIF-1 在機體對低氧濃度或缺氧應答中至關重要，能夠激活多種靶基因的轉錄，調控生長發育、生理應激及病理狀態過程，可以通過發揮抗衰老功能，延長maa-1 缺陷蠕蟲的壽命［28］。Ras 通過下游通路激活p53 從而誘導衰老，通過非依賴p53 的途徑產生OIS，同時可以通過失活C/EBPβ 逃逸衰老，K-Ras 也可以通過抑制p53 的活性逃逸衰老［29］。PI3K-Akt 信號通路參與調節細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等過程，激活PI3K-Akt 通路可以促進細胞系的生長和增殖，同時AKT 表達水平的升高可以保護細胞對抗衰老和凋亡。研究發現，胰島素樣生長因子1（IGF-1）經PI3K-Akt 通路調控2 型糖尿病患者骨髓間充質干細胞衰老及成骨分化［30］；外源性硫化氫可以激活PI3K/Akt/eNOS 信號通路，改善H2O2誘導的內皮細胞衰老［31］。哺乳動物的FoxO 家族包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4 和FoxO6，其中FoxO1 參與調節細胞增殖、細胞內氧化應激機體能量代謝及眾多生物學過程，miR-96-5p 可通過負調控FoxO1 調節成骨細胞的衰老、凋亡和成骨分化，從而影響成骨細胞的衰老過程［32］。FoxO3a 變異與許多種群的壽命有關，在皮膚角質形成細胞及成纖維細胞中均可表達，是PI3K/AKT 通路的關鍵靶點，PI3K/Akt/FoxO3a 通路激活可以逆轉TNF-α 引起的GNRH1 基因抑制和NF-κB 激活，有助于防止衰老相關的下丘腦GnRH 釋放減少［33］。FoxO4 是胰島素/胰島素樣生長因子信號通路的靶點和活性氧的調節因子，與細胞衰老和組織穩態密切相關。靶向抑制FoxO4 的表達可有效延緩人臍帶間充質干細胞的衰老［34］。調控蛋白Rap1 與衰老密切相關，Rap1缺陷會加劇端粒磨損，通過激活p53，從而抑制PPARα 的表達，小鼠心臟出現衰老相關表型以及脂肪酸代謝降低，Rap1/p53/PPARα 信號可能是預防/減輕心臟衰老的治療靶點［35］。在低劑量化療藥物誘導的胃癌細胞衰老過程中，可見Rap1 表達升高，且促進了SASP 相關因子的表達［36］。最后，通過AutoDock 分子對接發現黃芩素、4′，5-二羥基黃酮、甘草素、（2R）-7-羥基-2-（4-羥基苯基）-苯并四氫吡喃-4-酮、zhonghualiaoine 1 等成分與EGFR、VEGFA、HIF1A、ESR1、STAT3 等靶點相互作用，表明黃精具有抗衰老的功效。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學聯合分子對接的方法對黃精抗衰老的物質基礎和作用機制進行探索，從分子水平對其作用機制進行系統分析，黃精中黃芩素、4′，5-二羥基黃酮、甘草素等活性成分可以通過多靶點、多途徑抗衰老，從而為其分子機制的深入研究、臨床應用以及保健產品開發研究提供思路。