基于網絡藥理學及分子對接探討靈芝藥理機制

陳姎玲，潘小芳，徐 浩，陳 睿，霍麗妮，梁 燕

（1.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530200；2.廣西醫科大學藥學院，南寧 530021）

靈芝（Ganoderma lucidum）始載于《神農本草經》，別稱瑞草、仙草、赤芝等，在中國存在兩千多年的藥用歷史，其中紫芝和赤芝的子實體被《中華人民共和國藥典（一部）》收錄藥用。靈芝是靈芝科靈芝屬藥食同源真菌，其味甘，性平，歸心、肺、肝、腎經，具有止咳、平喘、補氣、安神等功效［1，2］，從古至今一直被用作促進身體健康、永葆青春活力、延年益壽的良藥。現代科學研究發現靈芝具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、保肝護肝和調節免疫等藥理作用［3-5］，其化學成分主要包含多糖類、三萜類、甾醇、蛋白質、氨基酸、核苷類等活性成分［6］，目前已被廣泛用于藥品、保健品以及化妝品等領域［7］。由于傳統中藥化學成分較為復雜，且常具有多靶點協同作用的特點，難以從整體對其藥理機制以及構效關系進行系統研究。近年來，從多成分、多靶點的角度出發，利用大數據系統深度挖掘和揭示中藥的藥理作用機制逐漸成為一種新趨勢。

網絡藥理學（Network pharmacology）是由Hopkins［8］首次提出概念，其基于系統生物學及藥理學范疇，通過構建化合物與基因、蛋白靶點和疾病等之間的相互作用網絡，從整體性和系統性角度分析中藥活性成分及相關藥理機制［9，10］。網絡藥理學注重藥物、靶點、疾病三者之間互相協同、互相作用，在一定程度上可以解決中藥及復方研究中多成分、多靶點、協同作用特點帶來的難題。因此，本研究借助網絡藥理學方法并結合分子對接技術，檢索靈芝中的關鍵活性成分并對其相關靶點及信號通路進行預測分析，全面系統地對靈芝的主要活性成分及藥理作用機制進行分析與挖掘，為科學研究活性成分、開發標準化功能性食品提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 網絡平臺

系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、Swiss target prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平臺、DAVID 6.8 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）、Cytoscape 3.7.1 軟件、RCSB 平臺（https：//www.rcsb.org/）、SYBYL2.0 軟件。

1.2 方法

1.2.1 化學成分收集與活性成分篩選 通過重要系統藥理學數據庫與分析平臺，檢索靈芝所含的化學成分，共得到靈芝的化學成分242 個，再以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥40% 及類藥性（drug-like，DL）≥0.18%為限制條件，篩選出靈芝的有效活性成分，這些成分可作為預測靈芝作用靶點的物質基礎。

1.2.2 潛在作用靶點的收集 將篩選得到靈芝的活性成分以SMILE 格式逐個導入Swiss target prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平臺，將研究對象設為“Homo sapiens”，預測并整理相關化合物的潛在作用靶點，這些靶點將用于進一步構建靶點-生物通路間的相互作用網絡。

1.2.3 GO 基因注釋及KEGG 富集分析 運用DAVID 6.8 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對上述靶點蛋白進行基因本體（Gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。輸入靶點信息后限定靶基因名稱列表為“Human”，收集并整理數據，得到靶點在基因功能的富集情況和相關作用通路。

1.2.4 網絡圖譜構建與分析 使用Cytoscape 3.7.1軟件將篩選得到的活性成分和靶點建立模型；根據DAVID 數據庫中的分析結果，構建靈芝的活性成分-靶點-作用通路（Compound-Target-Pathways，CT-P）網絡圖。基于網絡度（Degree）和介數（Betweenness）設置網絡圖節點的大小及顏色，以邊連接活性成分與靶點以及靶點與通路間的作用關系，最終得到靈芝的活性成分、潛在的蛋白靶點以及通路的關系圖譜。

1.2.5 分子對接驗證 通過RCSB 平臺（https：//www.rcsb.org/）篩選并下載關鍵靶點蛋白，利用SYBYL 2.0 軟件對配體小分子進行處理并構建關鍵蛋白的活性口袋，將活性成分和靶蛋白進行分子對接，得到對接后的對接得分（Total score），以預測二者的結合性能，進一步驗證本研究結果的準確性。

2 結果與分析

2.1 活性成分的篩選

通過TCMSP 對靈芝化學成分進行篩選，共獲得16 個活性成分，主要包括1 個多糖類化合物、8 個三萜類化合物及7 個甾體類化合物，分別為靈芝多糖B（MOL011172）、環氧靈芝醇B（MOL011172）、靈芝醛B（MOL011171）、Ganoderic aldehyde A（MOL011229）、靈芝酮醇（MOL011244）、赤芝醛A（MOL011266）、赤芝醛B（MOL011267）、赤芝醛C（MOL011268）、膽甾-7，22-二烯-3β-醇（MOL011137）、麥角甾-4，7，22-三烯-3，6-二酮（MOL011159）、（5R，10S，13R，14R，17R）-17-［（E，2R）-7-hydroxy-6-methylhept-5-en-2-yl］-4，4，10，13，14-pentamethyl-1，2，5，6，12，15，16，17-octahydrocyclopenta［a］phenanthren-3-one（MOL011251）、麥角甾-4，7，22-三烯-3，6-二酮（MOL011160）、麥角甾-7，22-二烯-3β-亞油酸酯（MOL011165）、麥角甾-7，9（11），22-三烯-3β，5α，6α-三醇（MOL011168）、過氧麥角甾醇（MOL011169）、麥角甾-7，22-二烯-3β-醇（MOL000282），它們均表現出較高的口服生物利用度和類藥性，所有化合物OB均在40%以上，大部分化合物的DL在0.80%以上（表1）。靈芝能有效治療急性腸炎、乳腺炎、肝炎等炎性疾病，多糖和三萜類化合物是靈芝抗炎的主要活性物質［11］。此外，靈芝中的三萜類化合物具有抗腫瘤、保肝護肝、降血脂和抗病毒等多種藥理功效［12］。靈芝多糖還能改善胰島細胞功能，抑制機體胰島素抵抗［13］，還能促進免疫細胞增殖隨后增強機體免疫力［14］，并在調節抗氧化功能方面存在重要作用［15］。林志彬［16］研究表明靈芝總甾醇以及靈芝多糖均可對抗缺氧再氧化過程對體外培養神經元的損傷，從而保護神經元的活性，由此表明，靈芝豐富的藥理活性可能與這些三萜類、甾體類及多糖類成分有關。

表1 靈芝的活性成分

2.2 活性成分靶點篩選及成分-靶點模型構建

將篩選獲得的16 個活性成分導入Swiss targetprediction 網站，預測出人源基因的相關蛋白靶點總數為240 個，包括63 個不同的蛋白靶點。運用Cytoscape 3.7.1 軟件將篩選的16 個活性成分連接上述靶點，繪制得到成分-靶點（C-T）網絡（圖1），共包含79 個節點（16 個活性成分和63 個潛在靶點）；左側節點代表活性成分，右側節點為靶點，活性成分與靶點的相互作用關系以線連接。在網絡中，節點的網絡度和介數值與節點的重要性呈正相關，節點的大小由其網絡度決定，網絡度越大，節點越大（表2），度數大的靶標蛋白可能是靈芝活性成分的核心靶點。

圖1 活性成分-靶點網絡

由圖1、表2 可以看出，不同的化合物均對應不同靶點，其中，雄激素受體（Androgen receptor，AR）是靈芝中16 個活性成分的共有靶標；類固醇生成相關靶點CYP17A1、CYP19A1 均對應了靈芝的12 個活性成分；此外，有10 個活性成分均與重組人酪氨酰胺DNA 磷酸二酯酶1（TDP1）、重組人微管相關蛋白（MAPT）、肝X 受體（Liver X receptors，LXRs）（NR1H2、NR1H3）、糖皮質激素受體（NR3C1）和鹽皮質激素受體（NR3C2）等靶點相關。其中，AR 屬于核受體超家族中的類固醇受體，主要存在于靶細胞的核內，張子彥等［17］報道表明AR 的變異與前列腺癌有關，還具有刺激骨髓造血的功能，廣泛用于再生性障礙性貧血的治療。類固醇生成相關蛋白CYP17A1 和CYP19A1，是細胞色素P450（CYP）的2個亞型，CYP17A1 和CYP19A1 的基因多態性與惡性腫瘤的發生發展密切相關［18-20］。NRIH2 和NRIH3是肝X 受體2 種同源亞型，LXRs 參與機體膽固醇代謝和轉運、脂肪形成、糖原異生和炎癥等多種生理活動的調節，與心血管疾病如動脈粥樣硬化、高血壓、心肌肥厚、心肌纖維化等的發生發展密切相關［21］。此外，有研究證明LXRs 可通過調控一系列信號轉導通路抑制癌細胞增殖、侵襲、誘導凋亡等，進而影響前列腺癌、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、白血病等多種惡性腫瘤的發生發展［22］。NR3C1 及NR3C2 基因多態性與心血管疾病以及一些癌癥有關。TDP1 是一種關鍵酶，可通過水解30 個磷酸酪氨酸鍵來修復與拓撲異構酶I（Topoisomerase I，TOPO-I）相關的DNA斷裂，因而TDP1 抑制劑常用來治療腫瘤［23］。MAPT基因是最早被發現與額顳葉癡呆有關的致病基因［24］。通過對靈芝中的活性成分相關靶點的分析，靈芝中的靈芝多糖、三萜類及甾體類等活性成分發揮藥理作用可能與這些核心靶點有關。

2.3 GO 和KEGG 富集分析

DAVID 為線上生物信息學分析數據庫，幫助識別并獲取大量的基因或蛋白質功能等信息［25］。為了闡明靈芝的藥理作用機制，將上述得到的63 個潛在靶點導入DAVID 數據庫，進行GO 基因功能注釋分析和KEGG 通路富集分析，經GO 注釋分析，共映射到116 個GO term，包括69 個生物過程（Biological process，BP）、16 個細胞組分（Cellular component，CC）和31 個分子功能（Molecular function，MF）。選擇P＜0.01，挑選出BP、CC、MF 共3 個部分最顯著富集的15 個GO term，如圖2 所示。其中，靈芝發揮藥理活性的生物過程與腺苷酸環化酶抑制G 蛋白偶聯乙酰膽堿受體信號通路（Adenylate cyclase-inhibiting G-protein coupled acetylcholine receptor signaling pathway）密切相關，而在細胞組分中與細胞連接（Cell junction）相關性最大，在分子功能中與蛋白激酶C 活性（Protein kinase cactivity）聯系緊密。通過KEGG 富集分析結果，靈芝的活性成分潛在的63 個藥效靶點共參與48 條信號通路，據此推測靈芝可通過多個靶點、不同生物通路協同發揮藥效。根據所得通路P大小，得到最顯著富集的通路15 條（圖3），其中包括Steroid hormone biosynthesis（類固醇激素生物合成）、Vascular smooth muscle contraction（血管平滑肌收縮）、Calcium signaling pathway（鈣信號通路）、Cholinergic synapse（膽堿能突觸）、Pancreatic secretion（胰腺分泌）、Inflammatory mediator regulation of TRP channels（炎癥介質對TRP 通道的調節）、Insulin resistance（胰島素抵抗）、Aldosterone-regulated sodium reabsorption（醛固酮調節鈉重吸收）、Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption（內分泌等因素調節鈣再吸收）、Retrograde endocannabinoid signaling（逆行神經信號）等信號通路。以上分析結果進一步確定了與靈芝活性成分相關的作用通路，為其藥理作用機制的進一步研究提供了參考方向。

圖2 GO 富集分析（P＜0.01）

圖3 KEGG 通路富集分析

2.4 活性成分-靶點-通路（C-T-P）網絡構建

根據KEGG 通路富集分析結果，利用Cytoscape軟件中“Merge”工具建立靈芝“活性成分-靶點蛋白-通路”（C-T-P）網絡模型，從而更直觀地觀察三者之間的作用關系。如圖4 所示，16 個活性成分（方形內圓節點）共對應到37 個潛在作用靶點（方形外圓節點），涉及相關信號通路15 條（V 形節點），節點的網絡度越大，節點越大，顏色越亮。根據C-T-P網絡模型可知，靈芝的活性成分可作用在多個靶點，對應多條通路，其中網絡中連接度排名前5 的活性成分為 MOL011169、MOL011229、MOL011266、MOL011171、MOL011157，連接度排名前8 的通路為Calcium signaling pathway（鈣信號通路）、Cholinergic synapse（膽堿能突觸）、Vascular smooth muscle contraction（血管平滑肌收縮）、Steroid hormone biosynthesis（甾類激素生物合成）、Neuroactive ligand-receptor interaction（神經活動配體-受體相互作用）、Insulin resistance（胰島素抵抗）、Inflammatory mediator regulation of TRP channels（炎癥介質對TRP 通道的調節）、Pancreatic secretion（胰腺分泌）。其中，鈣信號通路中重要因子發生差異表達與阿爾茨海默病密切相關［26］，血管平滑肌的收縮在多種血管病變的發生發展中發揮重要作用［27］。胰島素抵抗與糖尿病有關，炎癥介質對TRP 通道的調節涉及炎癥相關疾病，甾類激素生物合成可調控許多至關重要的生長發育過程，神經活動配體-受體的相互作用與老年癡呆等神經類疾病有關，這些通路與靈芝具備的抗腫瘤、抗糖尿病、抗衰老和調節免疫等藥理作用相關。

圖4 活性成分-作用靶點-通路（C-T-P）的網絡

2.5 分子對接驗證

在藥物設計領域，常利用計算機模擬結合及化學參數的運算技術實現受體-配體間的對接，進而預測出小分子化合物和大分子蛋白靶點的親和能力及結合方式［28］。通過分子對接對GO 和KEGG 富集結果進行分析驗證，用Surflex-Dock 對接得分結果評價配體和受體的結合能力，分數越高，則兩者結合穩定性越好。當對接得分高于4.25 分時，說明靈芝活性成分與靶點擁有一定的結合能力；當對接得分高于5.00 分時，說明靈芝的活性成分與靶點的結合活性較好；當對接得分高于7 分時，靈芝的活性成分與蛋白靶點具有強烈的結合能力［28］。分子對接結果（表3）表明，靈芝中60%以上的活性成分與其核心靶點能夠相互作用，且具有較好的結合活性，說明利用網絡藥理學方法預測結果的準確性較好。其中，麥角甾-7，22-二烯-3β-亞油酸酯與其關鍵靶點CYP17A1、HSD17B2、HSD11B1、HSD11B2、PTPM、PLA2G2A 等具有較高的結合能力，特別是與靶點HSD17B2的結合能力最高，其對接得分達12.169 7分。

圖5 麥角甾-7，22-二烯-3β-醇亞油酸酯與HSD17B2 的分子對接

為進一步研究靈芝活性成分與潛在蛋白靶點的作用方式，以得分最高的化合物麥角甾-7，22-二烯-3β-亞油酸酯為代表，采用Ligplot 工具對其與靶點蛋白HSD17B2 的結合模式進行分析。對接結果（圖5）表明，化合物整個甾體母核嵌入在活性口袋中，與Arg258、Leu262、Met47、Gly186、Pro187、Ser142、Lys159、Asn90、Thr140、Phe192、Gly92、Tyr155、Phe 226、Tyr218、Leu149、His221、Phe259、Val 225、Glu282 等多個氨基酸殘基形成了強烈的疏水作用，因而麥角甾-7，22-二烯-3β-醇亞油酸酯與HSD17B2 形成的復合物穩定性較好，這也是該化合物與靶點HSD17B2 具備較好結合能力的原因。

3 小結

本研究利用網絡藥理學方法，通過構建C-T-P網絡，考察靈芝在不同信號通路中的調節效應，以期揭示其分子可能的作用機制。研究結果表明，靈芝中三萜類、甾體類及多糖類成分是其發揮藥效的物質基礎，它們主要作用于CYP17A1、CYP19A1、NR1H2、NRIH3、PRKCG、PRKCB、HSD17B2、NO1、NO2、NO3、HSD17B12、HSD11B1、HSD11B2 等37 個關鍵靶點，參與血管平滑肌收縮、類固醇激素生物合成途徑、胰島素抵抗等15 個相關通路，這些靶點或通路與抗腫瘤、降糖、抗高血壓等多種藥理活性相關。本研究為促進傳統藥物靈芝的多維藥理機制研究及其在食品領域的進一步研究開發奠定了良好基礎。