丹酚A調控CD147-MMPs通路對大鼠缺血性腦卒中后神經的保護作用

趙卓琳 吳蛟 馬英 劉沁 蔣玲 陳道鋒

(1宜賓市第二人民醫院神經內科,四川 宜賓 644000;2川北醫學院附屬醫院神經內科)

缺血性腦卒中是由腦動脈狹窄/閉塞導致腦區缺血缺氧,進而造成神經元損傷及神經系統功能失調的常見腦血管病,是一種高發病率、高致殘率、高復發率疾病,占臨床腦卒中發病總數的80%左右。故探求新的神經保護劑對預防和治療神經病學具有重要裨益〔1,2〕。研究表明,缺血性腦卒中其病因及發病機制是由多因素引發的腦組織能量代謝障礙、氧化應激損傷、炎癥反應等系列病理反應,從而引發全身性臨床癥狀〔3,4〕。目前,臨床以靜脈溶栓、血管內介入為主要治療措施,雖療效顯著,但對錯過最佳治療時間窗患者療效欠佳〔5〕。丹酚(SA)作為植物提取的有效成分,具有特異的高選擇性κ阿片受體(KOR)激活動能。研究表明,SA效能遠高于其他現有的KOR激動劑,并具有良好的腦血管保護作用,但其機制及腦血管的作用機制尚不明確〔6,7〕?；诖?通過建立缺血性腦卒中大鼠模型給予SA干預,對其神經保護作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1動物及試劑 選取40只健康SD大鼠,鼠齡6～10 w,體質量200～261 g,平均(230.50±25.92)g,由江西中洪博元生物技術有限公司〔動物許可證：(贛)2020-0001〕提供。飼養條件：溫度(24.00±0.85)℃,12 h循環光照,按需攝入水食,避免外界刺激。過氧化氫酶(CAT)、丙二醇(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自滁州仕諾達生物科技有限公司;單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、炎性細胞因子間黏附分子(ICAM)-1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海篤瑪生物技術有限公司;5-羥色胺(HT)ELISA試劑盒購自武漢云克隆科技公司;基質金屬蛋白酶(MMPs)ELISA試劑盒購自江蘇艾博因生物科技有限公司。

1.2建模分組 大鼠隨機分為正常組、模型組、小劑量組、高劑量組,每組各10只,正常組不給予任何處理,模型組、小劑量組、高劑量組采用線栓法制備腦缺血模型。將大鼠稱重后,按照0.1 ml/10 g腹腔注射4%水合氯醛麻醉,仰臥位固定大鼠,75%酒精常規消毒頸部,于頸部正中做1 cm左右切口,切開右頸部皮膚,分離,于根部結扎頸外動脈,從右頸動脈分叉下方3.5 mm左右處做一“V”形口,插入3 cm尼龍線,當阻力出現時停止插入,此時尼龍線進入頸動脈約18 mm,待缺血90 min后緩慢抽出線栓,固定尼龍線并縫合皮膚,將大鼠放置于保溫棉墊上待其蘇醒后單籠飼養。采用Longa評分法〔8〕進行神經功能評分,1～4分大鼠視為缺血性腦卒中建模成功。

1.3干預 大鼠均建模成功,于建模成功后立即給予干預,參考人與動物體表面積等效劑量比值,計算大鼠給藥劑量,以1/2等效劑量為小劑量,2倍為高劑量。小劑量組腹部注射15 μg/kg SA,高劑量組腹部注射30 μg/kg SA,正常組、模型組注射等劑量0.9%生理鹽水,均連續給藥7 d。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 藥物干預7 d 后10%水合氯醛腹腔注射麻醉,心臟取血,離心處理5 min(轉速：3 000 r/min,離心半徑：12 cm),分離血漿,-20 ℃保存待檢。取血完成后,斷頭法處死大鼠,取出完整大腦,無菌分離腦組織,剪取部分腦組織制備勻漿液,將海馬組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定,24 h后脫水處理,石蠟包埋,切成4 μm切片,依次經二甲苯、梯度酒精水化后,蘇木素浸染5 min,鹽酸乙醇分色,自來水沖洗,1%伊紅染色2～3 min,脫水、透明、封片,光鏡進行觀察。

1.5神經損傷評分、腦梗死體積 神經損傷：于藥物干預后、取血前采用盲法記錄大鼠神經功能損傷評分,參照Longa的五級4分法標準,0分：無任何神經功能損傷癥狀;1分：無法完全伸展對側前爪,存在輕微神經功能損傷;2分：行走時向對側轉圈,中度神經功能損傷;3分：行走時向對側傾倒,重度神經功能損傷;4分：無法自行行走或昏迷。梗死體積：利用氯化三基四氮唑(TTC)染色測定腦梗死體積,Longa評分后每組隨機抽取3只大鼠斷頭處死,取出腦組織,切除嗅球、小腦、低位腦干作2 mm層厚冠狀切片,將腦片置于5 ml含有2% TTC溶液中,37 ℃恒溫、避光孵育30 min。TTC染色后,正常腦組織呈紅色,梗死腦組織呈白色。應用圖像分析軟件處理統計,計算每張腦片梗死面積。梗死體積(%)=(腦片梗死面積×厚度2 mm)/總體積×100%。

1.6氧化應激指標檢測 CAT采用鉬酸銨微板法檢測,MDA采用血清膽汁酸測定(TBA)法檢測,SOD采用比色法檢測,嚴格按照試劑盒操作說明書進行試驗,依次加入試劑盒中提供的試劑進行反應,并檢測與說明相對應的吸光度值。

1.7雙抗體夾心法檢測MCP-1、ICAM-1、5-HT、MMPs水平 檢測時酶標板分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔,每孔內均加入50 μl稀釋液,空白孔、標準孔、待測樣品孔內分別加入樣品稀釋液、標準品、待測樣片各 50 μl,輕晃均勻,酶標板覆膜,室溫孵育2 h。孵育結束后棄孔內液體,甩干,采用洗滌液反復清洗反應板。每孔內加入MCP-1、ICAM-1、5-HT、MMP-9檢測液100 μl,重新覆膜,室溫孵育1 h,棄孔內液體,甩干、洗滌反應板,每孔內加入100 μl底物溶液,室溫避光顯色30 min,加入50 μl終止液,輕彈酶標板終止反應。參照試劑盒說明書和儀器操作進行。

1.8Western印跡檢測各組CD147蛋白表達 取出大鼠待測腦組織按1∶5加入裂解液裂解、勻漿、提取總蛋白,經電泳、轉膜后,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗(CD147抗體,1∶1 000),過夜孵育。加入二抗(辣根過氧化物酶標記的二抗,1∶2 000),常溫孵育2 h,顯影、定影、沖洗、晾干,掃描膠片,采用ImageJ軟件分析CD147表達,以β-actin為內參,目標蛋白水平=目標條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.9統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行Kolmogorov-Smirnov檢驗、獨立t檢驗、F檢驗。

2 結 果

2.1各組腦組織病理 如圖1所示,正常組腦組織細胞結構完整、排列緊密;模型組、小劑量組可見不同程度的神經細胞水腫、壞死、間質充血、神經細胞周、樹突減少等腦缺血病理改變,可見大量炎性細胞浸潤情況;高劑量組存在輕微神經細胞水腫、壞死等腦缺血病理變化。

圖1 各組腦組織病理(HE染色,×400)

2.2各組神經功能損傷、腦梗死體積評估 如表1所示,相比模型組,小、高劑量組Longa評分、腦梗死體積較低,具有統計學意義(P<0.05);與小劑量組相比,高劑量組Longa評分、腦梗死體積較低,具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組神經功能損傷、腦梗死體積、腦組織氧化應激水平比較

2.3各組腦組織氧化應激水平比較 如表1所示,與正常組相比,模型組、小劑量組、高劑量組CAT、SOD水平降低,MDA水平升高,具有統計學意義(P<0.05);相比模型組,小、高劑量組CAT、SOD水平較高,MDA水平較低,具有統計學意義(P<0.05);與小劑量組相比,高劑量組CAT、SOD水平較高,MDA水平較低,具有統計學意義(P<0.05)。

2.4各組腦組織相關因子含量比較 如表2所示,與正常組相比,模型組、小劑量組、高劑量組MCP-1、ICAM-1含量升高,5-HT含量降低,差異有統計學意義(P<0.05);相比模型組,小、高劑量組MCP-1、ICAM-1含量較低,5-HT含量較高,差異有統計學意義(P<0.05);與小劑量組相比,高劑量組MCP-1、ICAM-1含量較低,5-HT含量較高,差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組腦組織相關因子含量及CD147表達、血漿MMPs水平比較

2.5各組腦組織CD147表達、血漿MMPs水平比較 如表2、圖2所示,與正常組相比,模型組、小劑量組、高劑量組CD147、MMPs表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);相比模型組,小、高劑量組CD147、MMPs表達水平較低,差異有統計學意義(P<0.05);與小劑量組相比,高劑量組CD147、MMPs表達水平較低,差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組腦組織CD147蛋白表達

3 討 論

研究表明,腦缺血損傷是一個多因素、多細胞介導的復雜病理過程。當腦缺血損傷發生時,炎性因子釋放入血導致白細胞聚集在血管及腦組織內,激活免疫炎癥反應參與腦組織保護過程〔9,10〕。本研究提示,SA對腦缺血腦卒中導致的腦損傷具有良好的神經保護作用。SA作為植物提取有效物,是迄今唯一天然、非肽類特異性的κ阿片受體激動劑〔11〕。既往研究表明,SA能夠有效擴張腦血管,保留腦缺血損傷后腦血管的自動調節能力〔12〕。相關研究表明,SA具有作用迅速而短暫、可控性強,易穿透血腦屏障,安全性高等優勢,在臨床治療中具有較好的應用前景〔13〕。本研究結果證實,SA可減輕腦缺血損傷造成的腦組織病理結構改變,對腦缺血損傷產生良好的神經保護作用。形成此結果的原因可能與SA可通過血腦屏障改善腦代謝,避免腦組織發生缺血損傷作用相關。

本研究指出,SA可提高腦缺血腦卒中大鼠CAT、SOD活性,減輕自由基損傷,改善微循環狀態,保護損傷腦組織。研究證實,氧化應激作為缺血性腦卒中的主要病理機制。正常狀況下,CAT、SOD等多種抗氧化酶廣泛分布于體內,可有效清除體內自由基代謝產物〔14,15〕。當機體受到缺血缺氧等有害刺激后,腦組織產生大量自由基,并通過多途徑產生級聯反應加重腦損傷〔16〕。本研究結果提示,氧化應激反應參與腦缺血腦卒中的發生、發展SA的抗氧化應激作用顯著。而炎癥反應作為腦損傷的重要致病機制,在腦缺血腦卒中發生、發展過程中扮演重要角色〔17〕。研究表明,MCP-1在正常腦組織中表達極低,當缺血、缺氧、損傷發生時,腦內多種細胞表達,在引發炎性反應的同時提高單核細胞表面黏附分子表達及炎癥細胞因子生產。ICAM-1作為細胞間黏附分子,在腦缺血后腦損傷病理、生理過程中扮演重要角色〔18,19〕。而5-HT作為重要神經遞質因子,正常情況下通過調節腦組織內神經纖維參與系列生理活動,并發揮重要作用〔20〕。相關研究指出,當缺血性腦卒中發生時,受神經損傷影響,5-HT含量貯存及攝取功能明顯降低,從而影響神經功能〔21〕。本研究結果表明,SA可有效抑制炎性細胞生成,減輕腦組織炎癥感應,提高腦組織中5-HT含量,發揮保護缺血腦組織作用。

本研究指出,SA對腦缺血腦卒中大鼠產生的良好神經保護作用可能與抑制CD147-MMPs通路激活相關。CD147作為跨膜蛋白是MMPs上游誘導分子,可上調MMPs表達〔22〕。相關研究表明,CD147在缺血大鼠模型中呈增加趨勢,相應的MMPs水平增高。同時CD147作為MMPs上游靶在多種中樞神經系統疾病中均有參與〔23〕。既往研究表明,MMPs在腦缺血損傷發生時含量顯著增加。MMP-9作為MMPs主要因子,可介導晚期血腦屏障的不可逆損傷〔24〕。本研究結果提示,SA對腦缺血損傷大鼠的神經保護作用可能與抑制抑制CD147-MMPs通路激活相關。

綜上,SA減少神經功能損傷評分,縮小梗死體積,抑制氧化應激反應、炎癥反應,增加腦組織中5-HT含量,有助于腦組織神經再生,發揮良好的神經保護作用,其機制可能與抑制CD147-MMPs通路激活相關。證實SA具有良好的神經保護作用,為神經保護劑研究提供一定參考依據。