LINC01410對肺癌細胞A549增殖、侵襲與遷移的影響

俞文豪 康小紅

(新鄉醫學院第一附屬醫院腫瘤放射治療一病區,河南 衛輝 453100)

肺癌發病率居惡性腫瘤的第二位,同時肺癌死亡率居惡性腫瘤的首位〔1〕。大多數肺癌患者早期沒有明顯癥狀,出現癥狀就診時多數已屬于晚期。手術、放化療、靶向治療和免疫治療等治療方法雖然可以改善病情,但患者總體預后仍較差〔2〕。因此,進一步研究肺癌發生發展的分子機制,尋找潛在的預測標志物和靶點具有重要的科學意義和臨床應用價值。

研究表明,長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤的發生發展和侵襲、轉移等過程中起重要作用〔3〕。LINC01410是新發現的lncRNA,研究表明,其高表達參與腫瘤的發生發展,如LINC01410參與骨肉瘤細胞的增殖、侵襲與遷移〔4〕;LINC01410促進神經母細胞瘤增殖、侵襲和放療抵抗〔5〕;此外,LINC01410介導胃癌細胞的血管生成和轉移〔6〕。然而,LINC01410在肺癌發生發展中的潛在機制尚不清楚。本文擬研究LINC01410對肺癌細胞A549增殖、侵襲與遷移的影響,并探討其可能分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人肺正常上皮細胞株BEAS-2B購于武漢中國典型培養物保藏中心。人肺癌細胞株PC-9、A549、H1975、HCC827均購于北京中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。0.25%胰蛋白酶、杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和青鏈霉素雙抗均購自美國HyClone公司。胎牛血清(FBS)購自美國Clark公司。慢病毒載體(LV-NC、LV-LINC01410)購于上海吉瑪制藥技術有限公司。Trizol試劑購自日本Takara公司。逆轉錄和聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒均購于近岸蛋白科技有限公司。基質膠及Transwell小室均購于美國Corning公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購于自索萊寶公司。白細胞介素(IL)-6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自達科為生物科技有限公司。Western印跡檢測所需一抗信號轉導及轉錄激活蛋白(STAT)3和p-STAT3 均購自美國CST公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于索萊寶公司;電化學發光液購于武漢博士德工程有限公司。

1.2細胞培養 37 ℃、5% CO2飽和濕度細胞培養箱,人肺癌細胞A549、H1975、HCC827、PC-9及人肺正常上皮細胞BEAS-2B,用含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養。應用0.25%胰蛋白酶消化傳代,選取處于對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3細胞轉染 將對數期A549細胞消化后,按照5×105個/孔接種于6 孔板中,置于細胞培養箱中常規培養過夜,當細胞融合度達到30%時,加入LV-NC、LV-LINC01410慢病毒載體(帶有綠色熒光蛋白)感染細胞。培養48 h,應用熒光顯微鏡觀察轉染效率,并應用實時熒光定量(qRT)-PCR檢測 LINC01410的表達水平。通過嘌呤霉素篩選,建立穩定表達細胞株A549-NC、A549-LINC01410。

1.4qRT-PCR實驗 采用Trizo試劑抽提細胞的總RNA,然后將RNA反轉錄成cDNA進行PCR,具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。IL-6引物序列：正向引物5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′,反向5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′;LINC01410引物序列：正向引物5′-ACAGCCCTGAGTGAA-AAGTCC-3′,反向5′-ACAAGATGCCTTGGAGTGTCA-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物序列：正向引物5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′,反向5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。應用2-ΔΔCt計算LINC01410和IL-6相對表達水平。

1.5MTT比色法檢測細胞活力 MTT將A549-NC、A549-LINC01410細胞常規消化后以3 000 個/孔鋪于96 孔板中,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度細胞培養箱培養,分為4組：24、48、72及96 h組(72 h及96 h組在48 h常規換液),每組設置5 個復孔,每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml),繼續在培養箱中孵育4 h。棄去上清液,每孔加入150 μl DMSO,于490 nm 處用酶標測定吸光度(OD)值。

1.6Transwell侵襲試驗 將基質膠按1∶6的比例稀釋,取稀釋后的基質膠100 μl,均勻鋪在Transwell小室的底部。用0.25% 胰酶將A549-NC、A549-LINC01410細胞常規消化,應用無血清DMEM培養基將細胞濃度調整為2.5×105個/ml。200 μl細胞懸液加入上室,600 μl含10% FBS DMEM培養基加入下室,置于細胞培養箱中24 h,取出小室。4%多聚甲醛溶液固定5 min,結晶紫染色15 min。 自然干燥后,用倒置顯微鏡隨機選取5個視野拍照,應用Image J軟件進行統計分析。實驗重復3 次。遷移實驗：Transwell小室不需鋪基質膠,余步驟同上。

1.7ELISA 細胞常規培養48 h后,收集A549-NC、A549-LINC01410細胞培養上清,1 200 r/min離心20 min,應用人IL-6預制ELISA試劑盒檢測IL-6表達水平,詳細步驟參照說明書。

1.8Western印跡實驗 將A549-NC、A549-LINC01410細胞接種于6孔板,常規培養24 h,棄上清,用預冷的PBS洗3次。每孔加入100 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF)和磷酸酶抑制劑的裂解液,置于冰上,搖動細胞板使細胞充分裂解30 min,4 ℃,12 000 r/min 離心15 min,取上清。BCA試劑盒定量、煮沸10 min變性,取30 μg蛋白上樣。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉至聚偏氟乙烯膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,用5%牛血清白蛋白V(BSA稀釋)的一抗4 ℃搖床過夜,二抗室溫孵育45 min,電化學發光液顯影,以GAPDH 為內參,應用Image J軟件分析目標條帶灰度。

1.9統計學方法 采用 SPSS30.0軟件進行獨立t檢驗。

2 結 果

2.1人肺癌細胞株和人肺正常上皮細胞LINC01410表達量 與人肺正常上皮細胞BEAS-2B(1.00±0.08)相比,4種人肺癌細胞株(A549、PC-9、H1975、HCC827)中LINC01410 表達(分別為1.29±0.07、1.78±0.21、3.36±0.20、6.75±1.03)顯著上調(均P<0.05)。其中肺癌A549細胞中LINC01410表達水平明顯低于其他肺癌細胞株(均P<0.05)。本研究選擇A549細胞進行后續實驗。

2.2A549細胞轉染慢病毒后LINC01410的表達 倒置熒光顯微鏡觀察轉染效果見圖1。qRT-PCR結果顯示,A549-LINC01410細胞中LINC01410 mRNA表達水平(96.44±10.76)明顯高于A549-NC細胞(1.01±0.19;t=15.36,P<0.05),提示轉染成功。

圖1 A549細胞轉染慢病毒(×40)

2.3過表達LINC01410對A549細胞增殖能力的影響 與A549-NC組相比,A549-LINC01410組在24、48、72和96 h的OD值明顯升高(均P<0.05),見表1。

表1 兩組細胞增殖能力、p-STAT3蛋白、IL-6 mRNA及蛋白表達比較

2.4過表達LINC01410對A549細胞IL-6表達的影響 qRT-PCR實驗結果顯示,A549-LINC01410組IL-6 mRNA表達水平明顯高于A549-NC組(P<0.05)。ELISA結果顯示,與A549-NC組相比,A549-LINC01410組IL-6表達顯著上調(P<0.05),見表1。

2.5過表達LINC01410對A549細胞p-STAT3蛋白表達的影響 與A549-NC組相比,A549-LINC01410組p-STAT3蛋白表達顯著上調(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測兩組p-STAT3蛋白表達

2.6過表達LINC01410對A549細胞遷移和侵襲的影響 與A549-NC組〔(198.33±17.16)個〕相比,A549-LINC01410組遷移細胞數〔(303.67±15.31)個〕明顯增加(t=7.935,P=0.001)。與A549-NC組〔(61.67±5.03)個〕相比,A549-LINC01410組侵襲細胞數〔(110.00±15.72)個〕明顯增加(t=5.073,P=0.007),見圖3。

圖3 兩組細胞遷移及侵襲能力(結晶紫染色,×100)

3 討 論

肺癌是中國及世界范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。國家癌癥中心統計顯示,2015年中國肺癌發病率和死亡率均居惡性腫瘤首位,其中新發病例約為 78.7 萬例,死亡病例約為63.1萬例〔7〕。近年來,隨著手術、放化療、靶向治療和免疫治療的開展,肺癌患者生存率有了明顯改善,但效果并不理想〔8〕,中國肺癌患者5年生存率僅為16.1%〔9〕。無限增殖、侵襲和局部遷移能力是惡性腫瘤細胞的關鍵性特征。相關研究〔10〕顯示,局部侵襲和遠處轉移是晚期肺癌患者最主要的致死原因。因此,深入探究參與肺癌細胞生長、轉移的相關分子及其信號轉導通路已成為當前的研究重點。

lncRNA 是一類長度>200核苷酸、不具備蛋白編碼潛能的RNA〔11〕。證據表明,lncRNAs參與細胞增殖、凋亡和侵襲等多種生物學過程〔12〕,其異常表達和突變與腫瘤的發生、轉移及腫瘤分期密切相關,例如,lncRNA雙同源盒A假基因(DUXAP)8促進胃癌細胞增殖和遷移〔13〕;lncRNA尿路上皮癌相關基因(UCA)1可促進膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移〔14〕;此外,lncRNA小核仁RNA宿主基因(SNHG)3促進乳腺癌細胞侵襲和遷移〔15〕。lncRNAs是一類新型的潛在生物標志物和治療腫瘤的靶點。目前lncRNA在肺癌中被廣泛研究,例如：lncRNA轉移相關肺腺癌轉錄本(MALAT)1促進肺癌腦轉移〔16〕;有證據表明,lncRNA HOX轉錄反義基因RNA(HOTAIR)可增強肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔17〕;此外,lncRNA細胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA(ANRIL)促進肺癌細胞增殖,抑制凋亡〔18〕。總之,lncRNA的出現為肺癌早期診斷和靶向治療提供了新的模式。LINC01410作為一個新發現的lncRNA,位于9號染色體的 62801465～62814286,全長 12 021 bp〔6〕。目前LINC01410在腫瘤中作用的報道僅限于骨肉瘤、神經母細胞瘤、胃癌、子宮內膜癌、結腸癌和膀胱癌等,例如：LINC01410參與子宮內膜癌細胞增殖、侵襲及遷移,并且LINC01410與子宮內膜癌的不良預后呈正相關〔19〕;LINC01410促進結腸癌細胞的增殖和侵襲〔20〕,同時LINC01410的高表達可作為大腸癌診斷和預后的潛在標記物〔21〕;此外,LINC01410介導膀胱癌細胞的遷移、侵襲和上皮-間充質轉化(EMT)〔22〕。這些發現提示LINC01410可能在腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移中起著重要作用,并且與腫瘤的不良預后有關。

本研究結果提示,LINC01410過表達促進肺癌A549細胞的增殖、侵襲和遷移。研究表明,IL-6/STAT3信號通路在肺癌中具有重要的促進作用,例如,間充質干細胞通過激活IL-6/STAT3信號通路可以促進肺癌的發生〔23〕;IL-6能通過誘導STAT3的活化促進非小細胞肺癌進展,阻斷IL-6能夠抑制肺癌細胞增殖〔24〕;此外,IL-6/STAT3信號通路可增強肺癌細胞侵襲和遷移能力〔25〕。本研究結果表明,肺癌A549細胞過表達LINC01410使 IL-6表達上調、STAT3活化。本研究推測LINC01410可能通過影響上調IL-6、激活STAT3表達來影響A549細胞增殖、侵襲與轉移,其具體機制有待分析。