健脾五穴點按法對老年功能性便秘大鼠的影響

史勇 李成浩 張紅石

(1長春大學特殊教育學院,吉林 長春 130022;2長春中醫藥大學護理學院)

功能性便秘(FC)是指無代謝功能障礙、無結構異常變化、無器質性病因,出現的以排便次數減少、大便干結、排便無力為主要癥狀的臨床病癥〔1〕。屬于中醫學“便秘”“脾約”范疇,是社區生活中較為常見的功能性疾病〔2〕。流行病學顯示,我國成年人FC的發病率為4%～6%,年齡越大,發病率越高〔3〕。長期便秘會引起腹脹、食欲下降、口內異味等癥狀,便秘產生的有害物質亦會增加患者并發胃腸道疾病的風險〔4〕。健脾五穴點按法治療老年FC,有著較好的臨床療效,但作用機制不明。因此,本研究主要是立足于對健脾五穴的實驗機制研究,圍繞“腦-腸軸”調節FC的關鍵作用,探討健脾五穴點按法治療老年FC的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級,Wistar大鼠40只,雌雄各半,9月齡,體質量300～350 g,購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司〔許可證號碼：SCXK(吉)-2020-0002〕。適應性喂養1 w,雌雄分籠,每籠5只,攝食飲水不限,自然照明,保持環境溫度22～24 ℃,濕度55%～60%。

1.2藥品及試劑 莫沙必利片,5 mg/片,國藥準字J20110022。復方地芬諾酯片(康普),2.5 mg/片,國藥準字H32022716。大鼠5-羥色胺(HT)、人血管活性腸肽(VIP)酶聯免疫試劑盒(96T;組織勻漿;上海茁彩生物科技有限公司,ZC35959J,ZC37398)。總RNA提取試劑(ml095476)、HG TaqMan miRNA反轉錄試劑盒(ml095527)、DNA Marker 2000(ml095609)、P物質(SP)兔抗多克隆抗體(ml091754)、促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)兔抗單克隆抗體(ml091933)均購自上海酶聯生物科技有限公司;β-actin鼠抗單克隆抗體(北京安諾倫生物科技有限公司,YM3029);阿拉伯樹膠粉(天津市光復精細化工研究所);異氟烷(上海玉研科學儀器有限公司);98%氯苯丙氨酸(PCPA,上海麥克林生化科技股份有限公司)。

1.3儀器設備 氣麻儀(上海玉研科學儀器有限公司,MR7654);9 cm鍉針(宸之瑞辦公專營店);酶標儀(BIOTEK,ELX-800);電泳儀(DYY-7C)、轉移槽(DYCZ-40D)、水平搖床(WD-9405B)均購自北京六一生物科技有限公司;實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)儀(Applied Biosystems,ABI7500)、超速冷凍離心機(湖南湘儀,H-2050R);電熱恒溫培養箱(天津泰斯特;DH36001B);離心機(益世科生物科技有限公司,MCR-88-8)。

1.4動物分組及造模 40只Wistar大鼠,喂養7 d后,分為雌雄兩籠,每籠20只,按體質量隨機分為空白組、模型組、穴位按壓組、陽性藥物組,每組10只,雌雄分籠各半。空白組給予2%蔗糖灌胃,其余各組采用復方地芬諾脂混懸液建立FC大鼠模型,將復方地芬諾酯片溶解稀釋后按大鼠10 mg/kg灌胃,每天1次,連續14 d,當大鼠出現首粒黑便排出時間延長時,為FC模型造模成功。

1.5實驗動物干預及取材 空白組、模型組：每日正常飲食飲水,不做干預治療。穴位按壓組：采用9 cm鍉針進行健脾五穴按壓治療,大鼠治療前采用氣麻儀固定在鼠板上,以鍉針垂直在大鼠神闕、中脘、章門(左右)、天樞(左右)和氣海進行點按,力度以鍉針自身重力為最大值,每日1次,連續治療7 d。大鼠穴位定位參照文獻〔5〕。陽性藥物組：將莫沙必利溶解稀釋后按人鼠比例1∶30進行等效劑量換算灌胃(每100 g大鼠給予25 mg藥物),每日1次,連續7 d。干預結束后,禁食24 h。麻醉成功后,經腹主動脈采血5 ml,從降結腸與乙狀結腸交界處向上取50 mm×3 mm×3 mm腸組織,分別存于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.6首粒黑便時間及糞便含水率檢測 分別于造模14 d及治療7 d清晨給水30 min后,給予10 ml/kg的墨汁灌胃,記錄每只大鼠墨汁灌胃時間及各組大鼠的首粒黑便排出時間。糞便含水率(%)=(糞便濕重-糞便干重)/糞便濕重×100%。

1.7血清酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 檢測大鼠血清5-HT和VIP的含量。按ELISA試劑盒說明測定各組大鼠血清5-HT和VIP的含量。建立標準曲線的直線回歸方程式,計算出每個樣品5-HT和VIP 的含量。

1.8結腸組織PCR檢測 將結腸組織置于離心管中,加入 TRNzol總RNA提取試劑進行總RNA提取,采用分光光度計測定樣品濃度和純度,逆轉錄合成cDNA,隨后進行PCR。SP：上游引物5′-GCATTGCCTCCTTGATTTGG-3′,下游5′-TGGCGGTC-TTTTT TCTCGTT-3′,81 bp;CRF：上游引物5′-TCTCTGGATCTCACCTTCCACCTT-3′,下游5′-AGTTTCCTGTTGCTGTGAGCTTGC-3′,92 bp;(引物由美國 Invitrogen 生物技術有限公司合成,以 GAPDH為內參),數據采用RQ=2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.9Western印跡 檢測結腸組織中SP、CRF蛋白表達。采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量,完成蛋白提取、定量、電泳、轉印、封閉、抗體孵育、底物發光等,完成膠片掃描,采用圖像處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶及光密度值。蛋白的相對含量以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

1.10統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組治療7 d后首粒黑便排出時間及糞便含水率比較 治療7 d后,各組首粒黑便排出時間比較：模型組>穴位按壓組>陽性藥物組(均P<0.05);模型組糞便含水率明顯低于穴位按壓組、陽性藥物組(均P<0.05),穴位按壓組和陽性藥物組糞便含水率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組治療7 d后首粒黑便排出時間、糞便含水率、血清5-HT、VIP和SP、CRF mRNA及蛋白水平比較

2.2ELISA檢測各組5-HT、VIP水平 模型組5-HT明顯低于穴位按壓組、陽性藥物組,模型組VIP水平明顯高于穴位按壓組、陽性藥物組(均P<0.05),穴位按壓組和陽性藥物組5-HT、VIP水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3PCR檢測各組結腸組織SP、CRF mRNA和蛋白水平 模型組SP、CRF mRNA和蛋白水平明顯低于穴位按壓組、陽性藥物組(均P<0.05),穴位按壓組和陽性藥物組SP、CRF mRNA和蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1和圖1。

圖1 Western印跡檢測各組結腸組織SP、CRF蛋白表達

3 討 論

FC是消化系統常見的功能性胃腸道疾病,發病機制尚未完全明確。西藥治療主要以刺激性瀉藥為主,效果欠佳,容易反復,長期便秘發作甚至會誘發心腦疾病〔6〕。中醫治療療效確切持久、治病求本、歷史悠久,副作用少,有獨特的優勢,中醫學家認為FC的病因病機主要從脾胃論治,常兼其他臟腑病變〔7〕。治療方法有中藥方劑內服施治、中醫外治兩類。中藥根據臨床癥狀、舌脈表現,四診合參進行辨證分型施治,效果顯著。外治方法多樣化,以針灸治療、穴位貼敷、穴位注射、推拿療法、中藥灌腸為主,療效顯著〔8〕。健脾五穴,是中醫腹部按摩常用的推拿選穴。選穴包括神闕、中脘、章門、天樞、氣海。神闕是駱競洪九宮腹部推拿中的中宮,善于運氣健脾,調暢氣機;中脘、章門,一臟會一腹會,是臟腑點穴中兩個合用穴;氣海有提氣健脾之法,臨床效果頗為明顯;天樞為天地交接之處、氣機轉輸之紐,點按此穴有利于助氣海,運氣下行。健脾五穴點按法治療老年FC臨床療效較好,但因缺少有效的機制支撐,故阻礙了有效的臨床推廣及應用。近年來研究發現,“腦-腸軸”調節失衡在FC發病過程中扮演了重要的角色,該學說正逐漸成為FC機制研究的新熱點〔9〕。相關研究表明,5-HT、VIP、SP、CRF等腦腸肽的表達差異可影響患者的胃腸排空功能和腸蠕動,并與FC的發病密切相關〔10〕。本研究在以往臨床研究及動物研究的基礎上,結合現代理化技術、模型技術、動物治療技術等,開展針對健脾五穴點按法治療老年FC大鼠影響的研究,從“腦-腸軸”調節上闡述健脾五穴對老年FC的影響作用。

綜上,經健脾五穴按壓治療后,提高了FC大鼠結腸組織中SP、CRF mRNA表達和蛋白活性,對腦腸肽的紊亂具有調節作用,促進了大鼠排便,改善了FC癥狀。