“固元扶陽”穴位針刺法對EAE小鼠的影響及機制

唐惠珍 李欣欣 李靈超 蘇醒 潘志 馬長春 樸松蘭

(長春中醫藥大學,吉林 長春 130117)

多發性硬化(MS)是一種病因尚未闡明的自身免疫性慢性疾病,以中樞神經系統(CNS)炎細胞浸潤伴有脫髓鞘為其主要特征性病變〔1〕,最終會進展為神經元損傷、軸突丟失和膠質細胞增生,造成神經系統功能不可逆損傷〔2〕。常見的臨床癥狀有步態異常和視覺、感覺、膀胱或直腸功能障礙等及較難直接量化的癥狀如疲勞、抑郁和疼痛等〔3〕。目前MS的病因和發病機制尚未明確,臨床上常用的藥物主要通過抑制T、B細胞免疫應答發揮治療作用,但療效不明確〔4〕,且需長期使用、伴隨多種不良反應等,導致患者依從性低。因此尋求有效、簡便且不良反應少的治療手段意義深遠。臨床研究結果顯示,針刺治療可以改善MS患者神經功能缺損癥狀,延緩或減少MS復發〔5〕。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的病變與MS相似,是常用于MS實驗研究的經典動物模型〔6〕。本實驗以“固元扶陽”穴位針刺法干預EAE小鼠,以探討穴位針刺對EAE小鼠的影響,為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雌性C57BL/6小鼠44只,SPF級,6～8周齡,體質量18～20 g,購于沈陽長生動物股份有限公司〔生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001〕,經長春中醫藥大學動物實驗倫理委員會審批備案(批準編號：2020347),飼養于長春中醫藥大學動物房,環境通風清潔,溫度20～24 ℃,相對濕度40%～60%,明暗周期12 h,正常飲食,動物適應性喂養1 w后開始實驗。

1.2主要試劑與實驗儀器 髓鞘少突細胞糖蛋白35-55肽段(北京賽百盛,貨號：201208-1);滅活結核分枝桿菌(上海瑞楚,貨號：R19019);完全弗氏佐劑(CFA,Sigma,貨號：F1289);百日咳毒素(List Biological Laboratories,批號：180);蘇木素染液、伊紅染液(金克隆生物技術有限公司,貨號：(RS3530、RS3370);勞克堅牢藍(LFB)染液(經科生物,貨號：JK-192);小鼠白細胞介素(IL)-6、IL-17、IL-10酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(江萊生物,貨號：JL20268,JL20250,JL20242)。石蠟切片機、組織脫水機、石蠟包埋機、普通光學顯微鏡(徠卡儀器有限公司,型號：RM2255、TP1020、EG1150H、B1 SERIES);酶標分析儀(南京德鐵實驗設備有限公司,型號：HBS-1096A);呼吸麻醉儀(美國Tatrx公司,型號：VMR)。

1.3分組與造模 隨機分為正常對照組、模型對照組、針刺組、激素組,每組11只。適應性喂養7 d后,除正常對照組外均進行EAE造模處理。按參考文獻〔7〕的方法將MOG35-55肽段溶于磷酸鹽緩沖液(PBS),等比例(1∶1)加入含結核分枝桿菌的CFA,在冰面使用一次性三通管連接固定玻璃注射器進行反復吹打30 min以上,使其混合均勻,最終形成油水混合物。使用呼吸麻醉儀將小鼠麻醉后于脊柱兩側任意四點皮下注射抗原乳劑(含MOG35-55 250 μg,滅活結核桿菌800 μg,PBS 100 μl,CFA 100 μl),在造模當日(記為免疫第0天)及48 h后進行腹腔注射百日咳毒素稀釋液100 μl增強免疫。正常對照組與其他3組小鼠同時抓取、固定,并于同一時間相同位置進行等量生理鹽水注射。按照神經功能評分標準進行神經功能評分,評分≥1分即造模成功。

1.4針刺干預 于小鼠免疫第14日開始,每日固定時間進行干預。針刺組針刺“大椎”、雙側“腎俞”、雙側“足三里”,每日針刺1次,免疫第21日休息1 d,每次電針連續波2 Hz刺激10 min,共14次;激素組小鼠進行激素沖擊療法,每日給予醋酸潑尼松藥液0.1 ml/10 g灌胃(濃度為0.6 mg/ml)處理,免疫第21日休息1 d,共14次;正常對照組和模型對照組小鼠每日給予生理鹽水0.1 ml/10 g灌胃處理,免疫第21日休息1 d,共14次。

1.5體質量與神經功能評分 免疫第0天開始,每日觀察小鼠一般情況;每隔1 d記錄小鼠體質量并進行神經功能評分。免疫第29天對各組小鼠進行處理。參考國際通用的5分評分制,記錄小鼠的神經功能障礙評分。評分標準如〔8〕：0分：未出現任何癥狀;1分：尾張力減弱甚至消失,輕度步態笨拙;2分：一側后肢無力,被動翻動身后恢復;3分：雙側后肢癱瘓無力;4分：雙側后肢癱瘓伴前肢癱瘓;5分：瀕死或死亡狀態。癥狀在兩者之間,以±0.5分計。

1.6取材及標本處理 免疫第29天取材。每組選取6只小鼠的血清用于ELISA檢測：小鼠麻醉后,眼球取血法取血0.5～1.0 ml置于離心管中,室溫靜置30 min,在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min,取上層血清,于-20 ℃保存。每組取5只小鼠用于病理形態學研究：腹腔注射10%水合氯醛充分麻醉后,剪開胸腔,用生理鹽水灌注心臟,流出清亮液體后,改用4%多聚甲醛灌注,小鼠尾巴與四肢抽搐結束,取出完整脊柱,參考小鼠脊柱解剖圖確定脊髓L5段并完整剝離,4%多聚甲醛固定48 h。脫水、浸蠟、包埋,以4 μm厚度切片,進行病理形態學研究。

1.7組織學染色 采用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察炎癥細胞浸潤情況。取各組小鼠脊髓組織石蠟切片,按照染液說明書,將脊髓組織切片65 ℃預熱0.5 h復溫,放入二甲苯脫蠟至水,置于蘇木素染液4 min,后在鹽酸酒精中分化,氨水返藍,伊紅染液浸泡3 min,依次置于梯度酒精中脫水,中性樹膠封片,鏡下觀察脊髓組織白質區炎癥細胞浸潤情況并進行炎癥評分。評分標準〔9〕：0分：未見炎癥細胞浸潤;1分：呈現少量炎癥細胞浸潤;2分：小血管周邊呈“袖套樣”改變;3分：大面積炎癥細胞浸潤。

采用蘇克堅牢藍(LFB)染色觀察髓鞘脫失情況。取各組小鼠脊髓組織石蠟切片,按照染液說明書,將脊髓組織石蠟切片,經二甲苯脫蠟,浸入LFB染液A中57 ℃孵育4 h進行染色,梯度酒精脫水,中性樹膠封片,鏡下觀察脊髓組織脫髓鞘情況并進行脫髓鞘評分。評分標準〔9〕：評分標準：0分：未見脫髓鞘;1分：點狀脫髓鞘;2分;片狀脫髓鞘;3分：廣泛脫髓鞘。

1.8血清IL-6、IL-17、IL-10水平 依據ELISA試劑盒說明書,終止反應后用酶標儀450 nm波長下檢測各組血清中IL-6、IL-17和IL-10的吸光度(OD值),根據直線回歸方程計算出IL-6、IL-17和IL-10水平。

1.9統計學方法 采用GraphPad Prism9.5軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組體質量變化 免疫前各組體質量均無顯著差異(P>0.05)。實驗期間正常對照組小鼠體質量平穩增加。在免疫第10天,模型對照組、針刺組、激素組體質量開始下降。免疫第18天,模型對照組、針刺組、激素組小鼠體質量均下降至最低,其中免疫第10、18、22、28天模型對照組、針刺組、激素組體質量均顯著低于正常對照組(P<0.001),免疫第18、22、28天針刺組和激素組體質量明顯高于模型對照組(P<0.001);針刺組小鼠體質量略高于激素組,但兩組間無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組免疫不同時間體質量比較

2.2各組神經功能評分變化 正常對照組無神經功能缺損表現,模型對照組、針刺組和激素組小鼠從免疫第10天開始出現癥狀,飲食活動減少,精神萎靡,并逐漸出現尾部尖端下垂或單側或雙后肢癱瘓,行動不便、反應遲鈍,癥狀持續加重,部分小鼠出現四肢癱瘓;免疫第18天,EAE小鼠癥狀達到高峰期。與模型對照組比較,免疫第14、18、22、28天針刺組、激素組神經功能評分顯著降低(P<0.001,P<0.01,P<0.05);針刺組神經功能評分略低于激素組小鼠,但兩組間無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組神經功能、L5段炎癥評分分)

2.3各組脊髓組織結構變化 HE染色后顯微鏡下觀察,正常對照組L5腰椎脊髓前角周圍的白質區未見炎細胞浸潤,模型對照組相同部位白質區有大量炎細胞浸潤,針刺組和激素組相同部位白質區可見少量炎細胞聚集(圖1)。與正常對照組比較,模型對照組炎癥細胞浸潤評分顯著增加(P<0.001);與模型對照組比較,針刺組、激素組炎癥細胞浸潤評分降低(P<0.05);針刺組炎癥細胞評分略低于激素組,但兩組間無統計學差異(P>0.05)。見表2。

圖1 各組脊髓組織(×400)

2.4各組脊髓組織髓鞘染色 鏡下觀察,正常對照組脊髓L5段白質區髓鞘著色飽滿,模型對照組相同部位白質區髓鞘著色較淺、有大量空泡,針刺組和激素組相同部位白質區髓鞘著色有所改善(圖1)。與正常對照組比較,模型對照組脫髓鞘評分顯著增加(P<0.001);與模型對照組比較,針刺組、激素組髓鞘脫失評分顯著減低(P<0.01,P<0.05);針刺組脫髓鞘評分略低于激素組,但兩組間無統計學差異(P>0.05)。見表2。

2.5各組血清IL-6、IL-17、IL-10水平 與正常對照組比較,模型對照組血清IL-6、IL-17水平顯著升高(P<0.001),IL-10水平顯著降低(P<0.001),與模型對照組比較,針刺組、激素組血清IL-6、IL-17顯著降低,IL-10水平顯著升高(P<0.001,P<0.05);針刺組血清IL-10、IL-6、IL-17水平略高于激素組無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組血清IL-6、IL-17、IL-10水平比較

3 討 論

MS是高度致殘的中樞神經系統自身免疫性疾病,病灶呈現空間和時間的多發性〔10〕,臨床癥狀取決于中樞神經系統病變的位置,主要表現在感覺、視覺、運動和協調性障礙,痙攣、疲勞、疼痛和認知缺陷等〔11〕。其病因病機不明確,目前MS臨床一線治療藥物分注射和口服制劑,注射制劑常導致注射部位膿腫和感染〔12〕,口服制劑如芬戈莫德、富馬酸二甲酯存在感染、心血管病變和黃斑水腫等副作用〔13〕,在治療過程中需要考慮長期使用的安全性和耐藥性。針刺作為國際上認可的非藥物治療手段,主要通過免疫調節、抑制炎性損傷和促進神經修復等治療MS,能夠降低其復發率、改善神經功能損傷和臨床癥狀〔14〕,具有方法簡便、無不良反應等優勢。

MS的病理特征主要是炎細胞浸潤、脫髓鞘改變及軸索損傷。目前認為多種免疫活性效應細胞參與MS的病理過程,活化的T細胞、B細胞及巨噬細胞越過血腦屏障進入中樞神經系統,產生炎癥細胞因子,炎癥級聯反應導致過度炎癥反應,直接或間接造成MS脫髓鞘病變和軸索損傷,影響神經功能〔15,16〕。炎癥級聯反應過程中,CNS內不同類型的神經膠質細胞被激活。少突膠質細胞通過產生髓磷脂參與髓鞘的形成,炎性刺激引起少突膠質細胞數量減少或死亡,最終造成髓鞘損傷〔17〕。MS發病早期,過度炎癥反應誘導小膠質細胞向M1型極化,被激活的M1型小膠質細胞分泌細胞因子如IL-6等引起神經炎性損傷〔18〕。星形膠質細胞是CNS中維持神經元結構和發育的主要支持細胞,在MS發病時,細胞因子和髓磷脂降解產物激活星形膠質細胞,在損傷區域增生形成膠質瘢痕,阻止軸突損傷發展,但也阻礙了髓鞘再生〔19〕。因此,減輕CNS炎癥細胞浸潤、抑制炎癥因子釋放是治療MS的關鍵。

根據MS的臨床癥狀中醫多將其歸屬于“痿證”“痹證”的范疇,病位在腦和脊髓,病機多認為是腎精虧耗、髓海失充、督陽虛乏,治以補腎固本、填精補髓、振奮督陽為主〔20〕。本研究依據MS病機特點創立“固元扶陽”穴位針刺法,選取大椎、腎俞、足三里三穴：“大椎”穴是“陽脈之海”督脈的要穴,統領一身陽氣,針刺大椎穴可激發全身陽氣,祛邪外出,還可調節一身氣血運行,濡養四肢筋脈〔21〕;“腎俞”為腎的背俞穴,腎主骨生髓,針刺腎俞多有補益腎精、助陽化髓之功效,可改善脊髓的病變〔22〕;“足三里”為陽明經之合穴,胃之下合穴,主治“下肢痿痹,虛勞諸癥”,《素問 痿論》中提出“治痿獨取陽明”原則,陽明經多氣多血,針刺“足三里”起到補益脾胃、扶正固本之效,又可補益氣血、滋養宗筋〔23〕。三穴配伍運用針灸學上下配穴理論,具有固本培元、振奮督陽之功,以補腎固本填精、協調陰陽、扶正祛邪達到治療MS之效,充分體現了針刺治療中治病求本的思想原則。

細胞因子在MS中發揮調節免疫反應及炎癥反應的多重作用。IL-6是一種多效性細胞因子,在機體中發揮重要的促炎作用,活化的CD4+T細胞分泌IL-6刺激巨噬細胞釋放炎性介質加重炎癥反應,在MS病程中起到促進作用〔24〕。研究發現,在MS患者血清中IL-6水平升高,通過抑制IL-6的活性,能減輕MS的發病與進展〔25〕。本研究結果提示,針刺干預可以下調EAE小鼠血清IL-6水平。IL-17是由Th17細胞分泌的重要促炎細胞因子,可增加血腦屏障的通透性,促進炎細胞浸潤,促使神經纖維廣泛脫髓鞘和軸突發生不可逆的變性,與自身免疫系統疾病密切相關〔26〕。臨床研究顯示,在MS發病過程中,患者體內IL-17顯著升高,IL-17通過介導炎癥細胞在機體全身或局部發生炎性浸潤,造成嚴重的神經損傷〔27〕。本研究結果提示,針刺干預可以下調EAE小鼠血清IL-17水平。IL-10是由Th2細胞產生的一種抑炎性細胞因子,IL-10可以下調促炎因子的表達并使免疫作用變為免疫耐受,促進IL-10的分泌可以減輕EAE小鼠中樞神經系統炎癥浸潤〔28〕。本研究結果提示,針刺干預可以上調EAE小鼠血清IL-10水平。以上研究結果提示,針刺干預可以通過下調促炎因子IL-6、IL-17水平及上調抑炎因子IL-10水平從而減輕炎癥反應,發揮治療EAE小鼠的作用。