柴胡皂苷 d 對SH-SY5Y細胞體外抑制作用及機制

李妍 張紅 紀朋艷 蔡同建 陳泉瑛 呂權洲

(1吉林醫藥學院基礎醫學院,吉林 吉林 132013;2陸軍軍醫大學軍事預防醫學系;3吉林醫藥學院藥學院)

神經母細胞瘤(NB) 源于胚胎時期的原始交感神經或腎上腺髓質,可發生于頸部、腹部、腎上腺及盆腔等多個部位〔1〕。NB具有高度惡性,且腫瘤細胞侵襲性強,約70%的患者伴有轉移性疾病,臨床上NB的治療以手術治療為主,輔以放療和化療,但治療效果不佳〔2,3〕。傳統中藥材柴胡是傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根?！渡褶r本草經》將柴胡列為上品,其在中醫臨床上的用藥史已達兩千多年。因具有清熱解表、調肝理氣、扶陽正本等功效,柴胡被廣泛用于治療感冒發熱、寒熱往來、肝郁氣滯等癥。柴胡皂苷含量高,種類多,是柴胡的主要活性成分。現代藥理學研究發現,柴胡皂苷具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、神經調節和免疫調節等多種作用〔4～7〕。柴胡皂苷(SS)d是從柴胡中提取的一種三萜皂苷。大量研究證實,SSd具有廣泛的抗瘤作用,能夠明顯抑制肝癌細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞、黑色素瘤細胞等多種腫瘤細胞的生長增殖〔8～11〕。本文前期研究證實SSd能夠促進NB的SH-SY5Y細胞NB凋亡〔12〕。但SSd誘導SH-SY5Y細胞凋亡的具體分子機制尚不明確。本研究旨在探討SSd引起SH-SY5Y細胞凋亡的信號轉導通路及其具體分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞系及主要試劑 SH-SY5Y細胞購自中國科學院上海生命科學研究院;SSd購自中國藥品生物制品檢定所;杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)購自美國Hyclone公司;二甲基亞砜(DMSO)購自沈陽市華東試劑廠;胎牛血清購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司;活性氧(ROS)熒光探針(DCFH-DA)試劑盒購自上海碧云天生物技術公司;丙二醛(MDA)細胞測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體購自美國cell signaling technology公司。

1.2儀器 細胞培養箱購自北京東方安若生化科技有限公司;倒置顯微鏡購自日本Olympus公司;超凈臺購自蘇州凈化儀器廠;低溫高速離心機購自美國sigma公司;電泳儀及轉印槽購自北京六一儀器廠;細胞培養瓶購自加拿大JET公司。

1.3細胞培養及傳代 將SH-SY5Y細胞株置于含DMEM(內含體積分數為10%的滅活胎牛血清,100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素)的無菌細胞培養瓶中,在體積分數為5%CO2的37 ℃恒溫培養箱中常規培養。每2天進行1次傳代。

1.4SSd藥物配制及分組 準確稱取SSd標準品粉末,將SSd標準品粉末溶于含0.3% DMSO的DMEM,配制成終濃度分別為0(對照組)、4、8、10 μmol/L 的SSd組。

1.5細胞ROS水平檢測 細胞分組同上,取對數生長期的SH-SY5Y細胞,接種于24孔板中,恒溫培養箱中培養48 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞,按照試劑盒說明書進行操作,通過激光共聚焦顯微鏡瞬時測定2′,7′-二氯熒光素(DCF)含量,使用Image J軟件對熒光強度進行分析,分析不同濃度SSd處理條件下細胞內ROS含量,檢測各組熒光強度。

1.6細胞LDH含量測定 細胞接種于24孔板內,SSd處理SH-SY5Y細胞48 h,收集細胞培養液,取其上清液,按照試劑盒說明書進行操作,然后采用酶標儀分別檢測細胞上清液中LDH活性。

1.7細胞MDA含量測定 SH-SY5Y細胞接種于24孔板內,待貼壁后加入不同濃度的SSd生長48 h后,4 ℃離心,取其上清液,按試劑盒說明書進行操作,酶標儀檢測各組吸光度(OD)值。

1.8Western印跡檢測 SH-SY5Y細胞中CyclinD1、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2及Bcl-2相關X基因(Bax)蛋白表達：處理48 h后,胰酶消化,收集細胞,提取細胞總蛋白并采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。每孔加入50 μg蛋白溶液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,4 ℃低溫條件下電轉。5%脫脂奶粉封閉,將CyclinD1、Bax及Bcl-2一抗分別用封閉液按1∶1 000稀釋后加于NC膜上,4 ℃孵育過夜。Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗滌后加入辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗,孵育2 h后進行成像,以β-actin為內參,后顯影、定影。圖像經GeneGenius凝膠成像分析系統進行分析。

1.9統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行重復測量方差分析,組間比較采用Dunnett-t檢驗。

2 結 果

2.1SSd影響SH-SY5Y細胞ROS水平及MDA含量 與對照組相比,8、10 μmol/L SSd組細胞中ROS水平及MDA含量明顯增加(P<0.01,P<0.05),且有隨SSd濃度增加而升高趨勢。見圖1、表1。

表1 各組SH-SY5Y細胞ROS水平、LDH活性、MDA、CyclinD1、Bcl-2及Bax蛋白表達比較

圖1 不同濃度SSd對SH-SY5Y細胞ROS水平的影響(DCFH-DA染色,×200)

2.2SSd影響SH-SY5Y細胞LDH活性 與對照組比較,4、8和10 μmol/L SSd組LDH活性顯著升高(P<0.05,P<0.01),且呈劑量依賴關系。見表1。

2.3SSd影響SH-SY5Y細胞CyclinD1、Bax和Bcl-2 蛋白表達 與對照組比較,8、10 μmol/L SSd組Bcl-2表達顯著降低(P<0.01);4、8 和10 μmol/L SSd組Bax表達顯著升高,CyclinD1表達顯著降低(P<0.05,P<0.01),且SSd作用呈劑量依賴性。見表1、圖2。

1～4：對照組、4、8、10 μmol/L SSd組圖2 各組SH-SY5Y細胞CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達水平

3 討 論

迄今為止,NB的病因未完全闡明,目前認為其發病機制與環境因素和遺傳有關〔13〕。尋找有效且不良反應小的治療藥物對提高 NB患者的生存質量有重要意義,SSd是從中藥柴胡中提取純化的主要生物活性成分之一。Tang等〔14〕研究發現SSd可抑制肺癌細胞增殖并誘導其凋亡。同時,研究表明SSd通過下調多糖耐藥蛋白(MDR)1和P-糖蛋白(gp)的表達,可增強乳腺癌MCF-7細胞對阿霉素的敏感性〔15〕。另有研究證實,SSd可抑制胃癌細胞SGC-7901的遷移能力且呈劑量效應關系〔16〕。上述實驗結果均表明SSd具有廣泛的抗腫瘤作用。

氧化應激是指機體在各種理化因素作用下生成較多的ROS自由基和活性氮(RNS)自由基等活性分子,導致機體的氧化系統和抗氧化系統的平衡被破壞,引起機體損傷。當氧分子與單電子反應時可生成超氧陰離子,后者可進一步與電子反應生成過氧化氫、羥自由基等物質,這些氧化性質活躍的含氧分子統稱為ROS。藥物作用、細菌感染及組織缺氧等情況可導致細胞產生大量ROS〔17〕。MDA為細胞在各種理化因素作用下膜相關的脂質發生過氧化反應生成的產物,為機體發生氧化應激損傷的重要標志物,可代表細胞氧化損傷程度〔18〕。LDH參與機體的能量代謝,能夠催化乳酸與丙酮酸之間的相互轉化。LDH為細胞內酶,當細胞膜損傷時其細胞外含量增加,因此LDH的釋放量是判斷細胞膜的完整性及發生氧化應激損傷的重要指標〔19〕。本研究發現,SSd可通過增加SH-SY5Y細胞的氧化應激水平損傷細胞。

細胞增殖是生物傳代和生長發育的基礎。腫瘤的發病機制與細胞生長增殖相關基因的異常表達、功能失活、突變等改變密切相關。細胞分裂是增殖的關鍵環節,真核細胞的分裂周期主要分為分裂間期(G1、S、G2期)和有絲分裂期(M期),細胞在G1期合成所需營養物質,在S期進行DNA復制,在G2期進行線粒體及其他細胞器的復制。CyclinD1廣泛存在于真核細胞中,是Cyclin家族中的重要成員,能夠促進細胞從G1期向S期轉化。研究顯示,CyclinD1與多種腫瘤的發生、發展密切相關,在多種腫瘤細胞中均可檢測到高表達的CyclinD1〔20〕。本實驗發現,4～10 μmol/L SSd均可明顯抑制SH-SY5Y細胞中CyclinD1表達,提示SSd對SH-SY5Y細胞的增殖抑制作用與降低CyclinD1蛋白表達密切相關。

細胞發生氧化應激損傷是引起細胞凋亡的重要因素,過量的ROS會破壞線粒體膜的完整性,引起線粒體膜電位喪失,進而誘發細胞凋亡〔21〕;同時,有研究證實細胞凋亡與細胞增殖周期異常調控密切相關,在缺氧、某些毒物和藥物的作用下,細胞周期蛋白表達被抑制,細胞啟動凋亡程序〔22〕。本研究證實,SSd不僅能夠引起SH-SY5Y細胞發生氧化應激反應及CyclinD1表達抑制,同時能夠促進Bax蛋白表達,抑制Bcl-2蛋白表達,提示SSd可能通過誘導NB的SH-SY5Y細胞發生氧化應激損傷并引起細胞周期調控異常進而使凋亡相關蛋白表達異常,最終導致細胞凋亡。