褐藻素對脂多糖活化小膠質細胞誘導神經元損傷的保護作用

張琳琳 董筱茜 于穎澤 張家煜 牛韶祎 張晨昱 胡文婷 王蓉 趙文杰

(1海南大學藥學院 熱帶生物資源教育部重點實驗室,海南 ?？?570228;2海南醫學院第一附屬醫院神經內科)

慢性神經退行性疾病是一類以帕金森病、阿爾茨海默病和肌萎縮側索硬化為代表、中樞神經系統進行性神經元丟失為特征的神經系統疾病。近年研究證實神經炎癥在慢性神經退行性疾病的發生發展中發揮重要作用〔1～3〕。小膠質細胞作為一種中樞神經系統固有免疫細胞在神經炎癥中發揮重要作用。研究發現,當受到外界的刺激或者損傷時,小膠質細胞會被激活。激活的小膠質細胞產生致炎因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6,導致氧化應激產生大量自由基、活性氧(ROS)等,引發更嚴重的炎癥反應,最終導致神經元損傷,因而在神經退行性疾病致病過程中發揮重要作用〔4,5〕。褐藻素是一種從海藻中提取獲得的、含量最豐富的天然類胡蘿卜素。 研究發現,褐藻素具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和增強機體免疫等多種生物學功能〔6,7〕,然而到目前為止,褐藻素對被激活的小膠質細胞導致的神經損傷是否具有保護作用仍不清楚。本研究探討褐藻素對神經炎癥介導的神經元損傷的保護作用,為褐藻素成為神經系統退行性疾病治療藥物提供前期理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 BV2小膠質細胞購于中國科學院基礎醫學研究所細胞資源中心,SH-SY5Y細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。CCK-8試劑盒、線粒體膜電位試劑盒和ROS試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒購于上海ES science公司。小鼠 TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒和小鼠 IL-6 ELISA 試劑盒購于美國 Invitrogen 公司。南美胎牛血清購于AusGeneX 公司。

1.2CCK-8檢測BV2及SH-SY5Y細胞存活率 BV2或SH-SY5Y細胞,每孔細胞數1×105/ml 接種于96孔板,每個濃度設3個復孔,置于細胞培養箱24 h后,加入不同濃度褐藻素(0、5、15、20、25、30、40、80 μmol/L)培養24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,避光加入CCK-8溶液,放入培養箱孵育1 h。孵育結束,酶標儀450 nm檢測吸光度,計算細胞存活率。

1.3ELISA檢測TNF-α、IL-6水平 每孔細胞數為1×105/ml BV2細胞接種于24 孔板,每個濃度設3個復孔,置于細胞培養箱24 h后,分為正常對照組、脂多糖(LPS)組(濃度為200 ng/ml)、低劑量褐藻素治療組(200 ng/ml LPS+5 μmol/L褐藻素)、高劑量褐藻素治療組(200 ng/ml LPS + 25 μmol/L褐藻素),正常低劑量褐藻素對照組(5 μmol/L褐藻素),正常高劑量褐藻素對照組(25 μmol/L褐藻素)。培養24 h,取培養基上清,ELISA檢測TNF-α、IL-6水平。ELISA檢測步驟如下：每孔加入50 μl樣品稀釋液與50 μl樣品后,再加50 μl生物素化抗體,孵育2 h,孵育結束后,洗滌緩沖液洗滌5次,每孔加100 μl鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP),孵育 1 h。孵育結束后,洗滌緩沖液洗滌5次,每孔加入100 μl TMB底物溶液,避光顯色30 min后,每孔加入 100 μl 終止液終止反應,在450 nm下檢測其吸光度值,按照標準曲線計算TNF-α、IL-6濃度。

1.4線粒體膜電位檢測 每孔細胞數1×105/ml的BV2細胞接種于6孔板,培養24 h后,按照1.3分組,藥物處理24 h,按照試劑盒說明書,去除上清,預冷PBS 洗滌,避光每孔等量加入培養液和工作液,孵育20 min,去除上清,預冷1× JC-1染色工作液離心洗滌,收集細胞流式細胞儀檢測線粒體膜電位水平。

1.5細胞ROS檢測 BV2細胞,每孔細胞數1×105/ml,接種于6孔板,培養24 h后,按照1.3分組,藥物處理24 h,按照試劑盒說明書,去除上清,每孔加入1 ml2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),孵育20 min。PBS 洗滌,收集細胞,流式細胞儀檢測細胞ROS水平。

1.6CCK-8測定LPS誘導的BV2細胞條件培養基對SH-SY5Y細胞存活率的影響 BV2細胞,每孔細胞數1× 105/ml接種于 96孔板,每個濃度3個復孔,置于細胞培養箱 24 h后,按照1.3分組,藥物處理24 h,取各組條件培養基加入SH-SY5Y細胞處理24 h,避光加入 CCK-8 溶液, 放入培養箱孵育1 h。孵育結束,酶標儀450 nm 檢測吸光度,計算細胞存活率。

1.7Annexin Ⅴ-FITC試劑盒檢測凋亡 BV2細胞,每孔細胞數 1× 105/ml,接種于6孔板,每個濃度設3個復孔,置于細胞培養箱 24 h后,按照1.3分組,藥物處理24 h,取各組條件培養基加入SH-SY5Y細胞,處理24 h后,PBS洗滌,收集各組細胞。加1×結合緩沖液,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI,混勻,室溫避光孵育5 min,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.8統計學分析 采用GraphPadPrism9軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1不同濃度褐藻素對BV2細胞和SH-SY5Y細胞存活率的影響 0、5、10、15、20、25、30、40、80 μmol/L不同濃度褐藻素處理BV2細胞后,對BV2細胞均無明顯毒性;而0、5、10、15、20、25、30、40、80 μmol/L不同濃度褐藻素處理SH-SY5Y細胞后,40和80 μmol/L組細胞存活率明顯降低(P<0.05),呈濃度依賴性。5和25 μmol/L濃度的褐藻素對兩種細胞均無明顯藥物毒性,后續實驗采用這兩種濃度進行。見表1。

表1 不同濃度褐藻素對BV2和SHSY5Y細胞存活率的影響

2.2褐藻素抑制LPS誘導的BV2細胞TNF-α和IL-6水平 與正常對照組比較,LPS組TNF-α和IL-6水平均明顯增加(P<0.05),而高、低劑量褐藻素均可明顯抑制LPS誘導的TNF-α和IL-6的釋放(P<0.05),但高、低劑量褐藻素治療組間差異無統計學意義(P>0.05)。正常對照組和正常低、高劑量褐藻素對照組TNF-α和IL-6水平均無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 褐藻素對LPS誘導的BV2的TNF-α和IL-6、氧化應激、線粒體膜電位、細胞存活率、凋亡率的影響

2.3褐藻素可抑制LPS誘導的BV2細胞ROS水平 與正常對照組相比,LPS組ROS水平明顯升高(P<0.05)。高、低劑量褐藻素治療組ROS含量均明顯低于LPS組(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 褐藻素對LPS誘導的BV2細胞氧化應激的影響

2.4褐藻素可減少BV2活化后條件培養基共培養SH-SY5Y細胞的凋亡 與正常對照組相比,LPS組SH-SY5Y細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);高、低劑量褐藻素治療組SH-SY5Y細胞凋亡率相較于LPS組均顯著減少(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 褐藻素在各組LPS活化的BV2細胞條件培養基中對SHSY5Y細胞凋亡率的影響

2.5褐藻素在LPS活化的BV2條件培養基中對SH-SY5Y細胞的損傷作用 與正常對照組相比,LPS組SH-SY5Y細胞存活率明顯下降(P<0.05);與LPS模型組相比,高、低劑量褐藻素治療組SH-SY5Y細胞存活率則顯著上升(P<0.05);高、低劑量褐藻素治療組間差異無統計學意義(P>0.05)。正常對照組和正常低、高劑量褐藻素對照組細胞存活率無統計學差異(P>0.05)。見表2。

2.6褐藻素可改善LPS損傷的BV2線粒體膜電位水平 LPS組BV2細胞線粒體膜電位水平明顯低于正常對照組(P<0.05),高、低劑量褐藻素治療組均可明顯改善LPS誘導 BV2小膠質細胞活化引起的線粒體膜電位下降(P<0.05)。高、低劑量褐藻素治療組間差異無統計學意義(P>0.05)。正常對照組和正常低、高劑量褐藻素對照組線粒體膜電位無統計學差異(P>0.05)。見表2、圖3。

圖3 褐藻素對LPS誘導的BV2細胞線粒體膜電位的影響

3 討 論

褐藻素又被稱為巖藻黃質,已被證實具有多種生物學功能,如抗炎、抗凝血、抗腫瘤、抗血栓、抗病毒、抗氧化和增強免疫等諸多生物性功能〔6,8〕。研究發現,灌胃給予小鼠褐藻素,通過4 w的毒性試驗觀察,未出現明顯毒性,因此認為褐藻素安全性高,可作為潛在的海洋藥物〔8〕。褐藻素可以抑制LPS刺激的小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞IL-1β和IL-6等促炎因子的水平,從而起到抗炎作用。本研究結果發現,褐藻素可以顯著抑制LPS誘導的BV2細胞的TNF-α、IL-6的釋放,從而起到抗炎作用。過度激活的小膠質細胞會產生很多自由基,當ROS的產生與其清除及細胞修復的速度失衡時,細胞就會發生氧化應激〔9,10〕。過多的ROS會造成細胞損傷,導致線粒體功能障礙,出現線粒體膜電位下降,從而引起膜通透性增加、線粒體膜破裂、致炎因子釋放增多、DNA復制發生障礙,最終導致細胞凋亡〔11,12〕。本研究結果提示,褐藻素可通過抑制促炎因子的分泌,改善線粒體膜電位和抑制氧化應激,從而抑制小膠質細胞的活化。

本研究發現,褐藻素能明顯改善LPS活化BV2細胞條件培養基引起的細胞損傷。細胞凋亡是一種細胞程序性死亡方式,在細胞損傷中發揮重要作用,也是很多神經保護藥物作用的重要機制。本研究結果發現,褐藻素可以明顯抑制細胞凋亡從而發揮神經保護作用。

綜上, 褐藻素可以通過抑制BV2小膠質細胞活化,減少促炎因子釋放,改善線粒體膜電位,抑制氧化應激,從而對BV2小膠質細胞誘導的SH-SY5Y神經細胞損傷發揮保護作用,因而褐藻素未來有望作為治療慢性神經退行性疾病的候選藥物。