c-Myc、PD-L1、CAIX在肺腺癌中表達及其臨床意義

李子騰 袁江 李鵬 馮凱

(1濱州醫學院第一臨床醫學院,山東 煙臺 264003;2濱州市人民醫院胸外科)

肺腺癌是男性和女性肺癌患者中最普遍的組織學亞型,占肺癌總數的35%～40%,近年來發病率顯著上升,尤其在女性中增長迅速,已超過鱗癌成為最常見的病理型〔1〕。在一些北歐國家,女性患者的肺腺癌發病率已超過男性。肺腺癌的轉移與侵襲能力是臨床分期的重要依據。腫瘤的轉移由一系列連續、相互關聯的步驟組成,多個基因與環節牽涉其中,其中腫瘤細胞的免疫逃逸與腫瘤細胞對缺氧環境的適應在轉移中發揮重要作用。c-Myc作為一種原癌基因,在許多腫瘤中過表達,與女性乳腺癌關系密切〔2〕,在肺腺癌中亦有表達〔3〕。c-Myc可增強程序性死亡配體(PD-L)1表達,使免疫系統喪失對腫瘤細胞的監管〔4〕。并參與營造實體腫瘤細胞微環境缺氧狀態,調控碳酸酐酶(CA)Ⅸ表達升高,誘導癌細胞在缺氧環境中的適應性變化〔5〕。全基因組分析研究表明,數千個基因表達可能直接受c-Myc調控〔6〕。PD-L1、CAⅨ是c-Myc的下游因子。但c-Myc與其下游因子在肺腺癌中的研究尚不充分。本實驗擬分析c-Myc、PD-L1、CAⅨ在肺腺癌組織與良性肺組織中蛋白質的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1材料 選取濱州市人民醫院于2021年1月至2022年12月因外科手術切除或活檢的肺腺癌病理標本52例,所有患者術前沒有接受任何治療且病理診斷明確。另設20例良性肺組織(經病理證實)為對照組,以上標本均經甲醛固定,石蠟包埋。其中肺腺癌患者中位年齡65歲;根據第8版AJCC腫瘤分期手冊嚴格分期,該研究已得到所在單位倫理學委員會批準。

1.2相關試劑 兔抗人c-Myc、兔抗人PD-L1、鼠抗人CAⅨ購自基因科技(上海)股份有限公司,檸檬酸鹽抗原修復液、Maxvison檢測試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑購自福建邁新生物技術有限公司。

1.3實驗方法 采用免疫組化法,標本切片4 μm,經烘烤,脫蠟,水化后進行高溫高壓抗原修復,封閉內源性過氧化氫酶后,滴加一抗濕盒中4 ℃過夜。次日棄掉一抗,滴加二抗,并用DAB染色,蘇木素復染、組織脫水、石蠟透明。以已知陽性的切片作為陽性對照,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.4結果判定 c-Myc蛋白以細胞核與細胞質呈現棕黃色顆粒為陽性標記,CAⅨ蛋白主要定位在細胞膜,陽性者可觀察到胞膜染色為棕黃色,結果判讀采用半定量積分法,按每張切片著色深淺及陽性細胞比例進行判斷,染色陽性程度：無染色0分,淺黃色1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;陽性細胞百分比：<5%為0分,5%～24%1分,25%～50%為2分,>50%為3分。兩個定量數字相乘,總分值<2為陰性,≥2為陽性。PD-L1蛋白表達于細胞膜,陽性者可見細胞膜棕黃色染色。采用腫瘤比例評分(TPS),PD-L1表達陰性者TPS<1%,PD-L1表達陽性者TPS≥1%,其中TPS≥50%為PD-L1強陽性。

1.5統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行χ2檢驗、Spearman檢驗。

2 結 果

2.1c-Myc在肺腺癌與良性肺組織中的表達 肺腺癌組織c-Myc陽性表達23例(44.23%),在良性組織中表達3例(15.00%),差異有統計學意義(χ2=5.350,P=0.021)。不同臨床分期、有無淋巴結轉移的陽性表達率差異有統計學意義(P<0.05)。c-Myc在不同性別、不同年齡、有無吸煙史、不同腫瘤分化程度中無明顯差異,見表1。

表1 c-Myc、PD-L1、CAⅨ陽性表達與肺腺癌臨床病理參數的相關性〔n(%)〕

2.2PD-L1在肺腺癌與良性肺組織中的表達 肺腺癌組織PD-L1陽性表達19例(36.54%),在良性組織中無表達,差異有統計學意義(χ2=9.927,P=0.002)。有無吸煙、不同腫瘤分化程度陽性表達率差異有統計學意義(P<0.05)。PD-L1在不同性別、不同年齡、不同TNM分期、有無淋巴結轉移中無明顯差異(P>0.05),見表1。

2.3CAⅨ在肺腺癌與良性肺組織中的表達 肺腺癌組織CAⅨ陽性表達14例(26.92%),在良性組織中無表達,差異有統計學意義(χ2=6.684,P=0.010)。不同腫瘤分化程度陽性表達率差異有統計學意義(P<0.05)。CAⅨ在不同性別、不同年齡、有無吸煙史、不同TNM分期、有無淋巴結轉移中無明顯差異,見表1。

2.4c-Myc、PD-L1、CAⅨ三者在肺腺癌中表達相關性 c-Myc與PD-L1、CAⅨ(r=0.691、0.594)、PD-L1與CAⅨ均呈正相關(r=0.710,均P<0.05)。

3 討 論

肺癌患者生存時間與其臨床診斷發現的早晚密切相關。雖然低劑量螺旋CT的普及及人群健康意識的提高對早期發現、改善預后、降低肺癌死亡率意義重大,我國肺癌年齡標化5年生存率略有上升,但仍不超過20%,總體5年生存率仍偏低〔7〕,這主要是因為中國肺癌患者中60%是Ⅲ～Ⅳ期患者〔8〕。研究肺腺癌的分子機制,探究有助于肺腺癌診治與預后判斷的分子位點,對進一步提高肺腺癌的治愈率、降低死亡率等方面有重大意義。

原癌基因c-Myc屬于骨髓細胞瘤病毒癌基因Myc家族,作為一種原癌基因調節多種在腫瘤中至關重要的基因表達〔9〕。c-Myc可以通過調節PD-L1的表達,增強腫瘤對機體免疫應答的抑制作用。Xu等〔10〕發現肝癌中PD-L1在翻譯階段受到c-Myc的調節,增強PD-1/PD-L1介導的免疫逃逸,在c-Myc依賴的腫瘤進展中發揮關鍵作用〔11〕;Casey等〔12〕研究顯示,無論體內或體外實驗,c-Myc失活均會導致PD-L1 mRNA水平和蛋白質水平及免疫熒光快速下調。PD-L1的下調增強了抗腫瘤免疫反應,腫瘤生長停止。

c-Myc還參與癌細胞的代謝重編程〔13〕,可直接激活多個糖酵解及谷氨酰胺分解代謝相關基因的表達,進而直接促成癌細胞的Warburg 效應(有氧糖酵解),誘導代謝重編程以促進腫瘤發生〔14〕。而糖酵解的酸性代謝產物造成的細胞內酸化又進一步刺激了CAⅨ表達〔15〕。CAⅨ是一種跨膜二聚體鋅金屬酶,在癌細胞的pH調節中發揮關鍵作用,使這些細胞能夠適應腫瘤微環境的不利條件〔16〕。Hua等〔17〕研究發現,在非小細胞肺癌中c-Myc可通過上調長非編碼RNA LINC01123促進腫瘤增殖與有氧糖酵解;Yang等〔18〕發現在胰腺導管腺癌中糖酵解的活化使CAⅨ的表達上調。

同時,缺氧環境對腫瘤細胞的免疫逃逸存在促進作用〔19〕。Karimi等〔20〕通過研究缺氧條件下培養的腦膜瘤細胞,利用免疫組化法發現PD-L1與CAⅨ的表達具有相關性;Brooks等〔21〕研究發現,在頭頸癌中腫瘤微環境缺氧激活HIF信號傳導,CAⅨ表達增加,并上調PD-L1等免疫細胞抑制配體的表達。Koh等〔22〕在一項基于免疫組織化學和RNA測序數據的研究中發現PD-L1蛋白和mRNA的表達與CAⅨ的表達顯著相關。

本實驗結果顯示肺腺癌中c-Myc表達水平升高,繼而增加PD-L1、CAⅨ等基因的表達參與腫瘤的免疫逃逸、腫瘤細胞糖酵解代謝等過程,促進肺腺癌的發生、發展與轉移。聯合檢測這3個指標可能有助于患者預后的評估。雖然直接靶向c-Myc存在困難,但間接靶向c-Myc是治療肺腺癌的研究方向之一,本研究提示選擇性抑制c-Myc下游因子的表達聯合抗PD-L1免疫療法可作為一種治療肺腺癌的新策略。