SHH與胃癌、EBV(+)胃癌患者臨床病理特征和預后的相關性

劉曉梅 白光輝 郭云娣

(1蘇州衛生職業技術學院,江蘇 蘇州 215009;2蘇州市立醫院普外科)

胃癌(GC)是常見的惡性腫瘤之一〔1〕;2022年中國癌癥中心統計數據顯示：胃癌發病率僅次于肺癌,位列所有惡性腫瘤第二位,每年新發病例(40～50)萬例〔2〕,而在各種治療方式中,雖然化療和手術提供了很大的幫助,但對于晚期胃癌療效仍不盡如人意〔1〕。EB病毒(EBV)陽性〔EBV(+)〕GC是一種繼發于EBV感染的胃黏膜上皮細胞〔3〕克隆性生長的胃腺癌,這種GC類型具有獨特的信號通路,其相關的分子特征可以揭示藥物治療〔4〕的潛在靶點。SHH是編碼分泌型糖蛋白配體hedgehog(HH)蛋白的基因,主要在胚胎期參與細胞生長和分化,特別是在維持正常胃腸道生長和分化中發揮作用〔5〕。近年來,SHH在正常胃腸道及胃腸道惡性腫瘤中的表達也被報道〔5～8〕,但在EBV(+)GC中研究較少。本實驗探索SHH蛋白質在EBV(-)GC、 EBV(+)GC及癌旁正常組織中的表達模式及其與臨床病理參數、預后的關系。

1 材料與方法

1.1材料 收集蘇州市立醫院2000年1月至2010年12月住院患者手術切除GC病理蠟塊標本486例,由于較薄組織在切片時缺失,本組有效病例為375例〔檢測出EBV(+)GC 10例〕,之后另外收集EBV(+)GC 12例;鄰近正常組織(距腫瘤5 cm以上)200例。隨訪時間2～63個月。患者術前均未進行放、化療,所有標本經兩位病理專家閱片確診。患者無其他惡性腫瘤及心、肝、腎等重要器官嚴重損傷。排除臨床資料不完整者。本研究375例GC中年齡中位數為61.0歲。

1.2試劑 免疫組化：SHH抗體購自Abcam公司(EP1190Y,ab53281),為兔抗人多克隆抗體,用邁新公司抗體稀釋液以1∶200比例稀釋。高壓鍋PH為6.0的檸檬酸鹽液修復。采用Envision免疫組化法,以檸檬酸鹽緩沖液代替SHH為陰性對照。EB病毒編碼的小RNA(EBERs)原位雜交檢測試劑盒購于福建泰普生物科學有限公司,實驗按照說明書進行操作。

1.3組織芯片的構建 常規石蠟包埋蠟塊4 μm厚連續切片,常規蘇木素-伊紅(HE)染色后,用顯微鏡標記出對應蠟塊上的腫瘤組織或正常組織。自制10×16芯片蠟塊7個,每個蠟塊75例×2點;2個癌旁正常組織(距GC組織至少5 cm處)蠟塊8×10(每個蠟塊50例×2點),另外制作1個EBV(+)GC 單獨的芯片蠟塊〔8×5;375例GC芯片中篩選出的10例,再加上后續臨床確診EBV(+)GC 12例;3例胃正常組織和3例鼻咽癌組織〕,芯點直徑為1.6 ml。蠟塊(空位為芯片定位處)。SHH蛋白染色GC有效組織共375例,EBERs原位雜交陽性組織共22例。芯片技術的專利號為：200920350099.2。

1.4原位雜交、免疫組化染色及結果判定 EBV原位雜交EBERs染色結果判斷標準：僅細胞核棕褐色為陽性,細胞質和細胞膜在核分裂時可以有陽性著色,但視為陰性。SHH陽性表達于腫瘤細胞質,呈現棕黃色顆粒為陽性信號。結果判定方法按照文獻〔1〕方法：將各組織的染色強度和比例相加評分量化為陰性(0分)、弱陽性(1～2分)、中陽性(3～4分)、強陽性(5～6分)。但本研究只采用了兩種分類,將染色歸為低表達(4分及以下),過表達(5～6分)。

1.5統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行χ2檢驗、Spearman等級相關分析、Kaplan-Meier分析。

2 結 果

2.1SHH蛋白在 GC及癌旁正常組織中的表達 SHH在 GC組織中陽性表達于細胞質,其表達率為71.2%(267/375);在癌旁正常組織中亦表達于細胞質,其陽性率為61.5%(123/200);兩組間差異有統計學意義(χ2=20.012,P=0.000),SHH蛋白明顯高表達于GC組織中。見圖1。

2.2SHH陽性表達與GC臨床病理參數的關系 375例GC中,SHH陽性表達與年齡、性別、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、Lauren分型、血管侵犯、TNM分期均無關(P>0.05);只與腫瘤淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。見表1。

表1 SHH陽性表達與GC及EBV(+)GC臨床病理參數關系(n)

2.3SHH與EBV(+)GC相關性 SHH蛋白表達與EBV(+)GC原位雜交(圖2)的Spearman等級相關性分析顯示,22例EBV(+)GC中SHH蛋白表達21例,SHH蛋白表達與EBV(+)GC呈負相關(r=-0.129,P=0.012)。

2.4SHH與EBV(+)GC 生存分析 Kaplan-Meier生存分析：EBV(+)GC隨訪5例,隨訪6～45個月、EBV(-)GC隨訪151例,隨訪2～63個月(χ2=0.451,P=0.502); SHH表達陽性者隨訪109例,隨訪2～61個月;SHH表達陰性者隨訪40例,隨訪3～63個月(χ2=0.634,P=0.426),提示2個檢測指標均與患者生存時間無關。見圖3。

圖3 SHH與EBV表達GC患者生存曲線

3 討 論

哺乳動物中存在3個Hedgehog的同源基因：SHH、IHH和DHH,分別編碼SHH、IHH和DHH蛋白〔9〕。SHH蛋白作為一種配體在信號通路中發揮關鍵作用,以幫助胚胎發育、正常成人組織的維持、修復和腫瘤的發生,并在包括胃腸道在內的多種身體器官中均有表達〔10〕。本研究結果提示,SHH作為一種致癌蛋白可能在胃癌早期的發生過程中起關鍵作用,與Zhai等〔11〕的報道相同,而且SHH信號通路在成人組織中持續或異常的激活可促進癌癥進展〔12〕。在一系列惡性腫瘤中,包括皮膚、乳腺、肺、腦、前列腺和消化道〔12～15〕等器官中,HH通路的調控異常已被報道并與此類患者的生存期縮短有關,認為SHH可能是GC有用的生物標志物或治療靶點。Akhtar等〔5〕研究結果認為,SHH與患者生存相關,與本研究結果相一致,本研究結果提示,EBV(+)GC獨特的信號通路與EBV(-)GC不同,其相關的分子特征有可能揭示藥物治療的潛在靶點。

盡管90%以上的成年人為EBV攜帶者,但EBV感染極少見于非腫瘤胃黏膜上皮細胞,而幾乎所有腫瘤細胞中可檢測到單克隆EBV〔16〕,有研究〔16〕,胃癌中EBV感染率為3.7%(18/486),并同時存在于淋巴結轉移癌中,推測EBV感染建立于胃癌發生的早期階段,這些研究結果與隨后的〔17～20〕的研究相一致。隨著對胃癌研究的不斷深入,世界衛生組織(WHO)2019年消化系統腫瘤提出了EBV(+)GC這一具有特定分子特征和致癌機制的GC亞型。而EBV感染是否與SHH信號通路相關,目前尚未見明確的研究結果,但我們知道鼻咽癌與EBV感染有因果關系并表現出頻繁的HH通路調控異常〔11〕,在正常鼻咽鱗狀上皮中HH通路成分低表達,而在鼻咽癌(NPC)中大量表達SHH。結合本研究結果,提示SHH的異常表達可能是HH通路活性異常的結果。許多機制導致HH通路失調,Port等〔19〕研究發現,EBV對SHH的誘導可能導致通路失調,SHH過表達是否是GC的HH通路失調的唯一原因尚不清楚,尚需大量的基礎實驗來加以證明,但未來的研究將揭示GC發病機制中這些因素與腫瘤發展途徑之間的潛在相互作用及EBV在這一現象中所起的作用;這些發現可提示SHH通路可能是GC及EBV(+)GC潛在的新治療靶點。

綜上,SHH蛋白高表達于胃癌組織中并與其淋巴結轉移密切相關,而與其他臨床病理參數及患者預后無關;與EBV(+)GC呈負相關。雖然不排除這些相關性結果的偏差及實驗方法的不同或標本量不夠等因素,但這些結果仍可以提示使用特定抑制劑阻斷SHH通路可能是很有潛力的治療靶點。