富硒酵母姜黃素組合物對小鼠酒精性肝損傷的研究

欒金玲 朱婭敏 陳智仙 梁秋元 程倩

摘 要：目的：觀察姜黃素、富硒酵母和姜黃素聯合富硒酵母組對酒精中毒小鼠的保護作用。方法：將喂養的小鼠均勻分為空白組、模型組、姜黃素組、富硒酵母組和姜黃素聯合富硒酵母組，連續灌胃30 d，觀察小鼠肝損傷情況并檢測甘油三酯（Triglyceride，TG）、丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）等指標。結果：與模型組相比，姜黃素組及姜黃素聯合富硒酵母組小鼠肝臟指數下降，且差異具有顯著性；各劑量組小鼠肝臟MDA水平明顯下降，急性酒精灌胃后，姜黃素組、富硒酵母組及姜黃素聯合富硒酵母組小鼠的肝臟TG水平較模型組顯著降低，具有顯著性差異；各樣品組小鼠肝臟病理得分有所下降，脂肪面積占比顯著降低，具有顯著性差異。結論：姜黃素和富硒酵母對酒精導致的肝損傷具有協同作用，補充姜黃素和富硒酵母能通過對抗氧化應激和脂質過氧化損傷，有效地改善酒精導致的肝損傷。

關鍵詞：富硒酵母；姜黃素；肝損傷；小鼠

Study on the Effect of Selenium Enriched Yeast Curcumin Combination on Alcoholic Liver Injury in Mice

LUAN Jinling1，3， ZHU Yamin2， CHEN Zhixian1， LIANG Qiuyuan2， CHENG Qian1，3*

（1.National Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Yichang 443003， China;

2.Yichang Engineering Technology Research Center of Nutrition and Health Food， Yichang 443003， China;

3.Hubei Provincial Key Laboratory of Yeast Function， Yichang 443003， China）

Abstract： Objective： To observe the protective effects of curcumin， selenium-rich yeast and curcumin combined with selenium-rich yeast compositions on mice with alcoholism. Method： The mice were evenly divided into blank group， model group， curcumin group， selenium-rich yeast group and curcumin combined with selenium-rich yeast group. After 30-day administration， the content of triglycerides （TG）， malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH） and other indexes were determined. Result： Compared with the model group， the liver index of mice in the curcumin group and the curcumin combined with selenium enriched yeast group decreased significantly， and the difference was significant; The MDA levels in the liver of mice in each dose group significantly decreased. After acute alcohol administration， the TG levels in the liver of mice in the curcumin group， selenium enriched yeast group， and curcumin combined with selenium enriched yeast group were significantly reduced compared to the model group， with significant differences; The liver pathological scores of each sample group of mice decreased， and the proportion of fat area significantly decreased， showing significant differences. Conclusion： Curcumin and selenium rich yeast have a synergistic effect on alcohol induced liver damage. Supplementing curcumin and selenium rich yeast can effectively improve alcohol induced liver damage by combating oxidative stress and lipid peroxidation damage.

Keywords： selenium enriched yeast; curcumin; liver damage; mouth

肝臟對人體外來和自身代謝產生的許多有害因素具有強大的防御解毒功能，是人體消化系統中最大、最重要的消化腺體[1]。長期大量飲酒可引起肝臟、胃、心臟、腦組織等多個臟器損害，尤其是對肝臟的損傷最嚴重。在非病毒性肝病中，酒精性肝病居首位，重度飲酒者中，80%以上患脂肪肝，10%～35%可發展成酒精性肝炎，10%～20%將發展成肝硬化，而酒精性肝硬化預后差，比非酒精性肝硬化生存時間明顯縮短。目前，解酒保肝已成為醫學界與生物界需要解決的問題，加強對其的研究十分迫切。已有研究表明，乙醇肝損傷的機制與肝細胞膜脂質過氧化增強密切相關[2]。在當前的治療中，對于酒精肝損傷患者，戒酒是西方國家的主要治療方式，更為有效的治療手段還在研究中。因此，國內和國外出現了很多保護肝臟的健康食品，用來緩解肝損傷，我國有很多食品具有很好的加速酒精代謝和保護肝臟的功能。

姜黃素是姜科植物（姜黃、莪術、郁金等）的主要生物活性成分之一。近幾年研究結果顯示，姜黃素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗血管生成、清除自由基、保護心血管系統和消化系統等功效[3]。此外，研究發現姜黃素對于酒精性肝損傷具有很好的修復作用[4-7]。硒具有保護肝臟和防治肝病的功能，是人體內所必需的微量營養元素之一[8-11]。硒是構成谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）的重要組成成分，作為人體必需的微量元素，可以清除體內的過氧化物質，避免細胞膜的結構和功能受到過氧化物的損害，從而降低機體的氧化損傷[12]。富硒酵母是一種經生物工程技術轉化產生的富含微量元素硒的有機生物制劑，其含有的硒能被人和動物最大程度地吸收并參與機體代謝。目前，已經獲得衛健委的批準，富硒酵母可以作為營養強化劑和保健食品原料使用。姜黃素和富硒酵母作為食品原料，在營養保健食品的使用中具有法規限量。為了擴大姜黃素和富硒酵母在食品中的應用范圍，同時為了提高人們對于日常護肝的意識，本文研究了低劑量的姜黃素和富硒酵母對于酒精性肝損傷小鼠的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

富硒酵母（硒含量2 000 mg·kg-1），安琪酵母股份有限公司；姜黃素，Sami-Sabinsa Group Limited，保存條件為陰涼干燥；甘油三酯測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒，南京建成生物有限公司；還原型谷胱甘肽測定試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術研究所。

1.2 實驗動物

SPF級C57BL/6J、雄性成年小鼠60只，體重18～20 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK<湘>2019-0004，于華中科技大學同濟醫學院農藥毒理研究中心飼養[實驗動物設施許可證號：SYXK（鄂）2019-0046]。環境溫度（20±2）℃，相對濕度55%～75%。小鼠飼料由華中科技大學同濟醫學院農藥毒理研究中心提供。

1.3 儀器與設備

電子天平，德國Sartorious；多功能酶標儀，美國BioTek公司；5810R低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；熒光倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠；恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；恒溫培養箱，日本SANYO 公司；KZ-III研磨儀經濟型，天津賽維爾公司。

1.4 實驗方法

采用《保健食品檢驗與評價技術規范（2003版）》中第19項“對化學性肝損傷有輔助保護功能”方案二（酒精肝損傷模型）方法。將60只成年小鼠隨機分為5組，每組12只，受試物具體分組如下：①姜黃素劑量組[姜黃素16.67 mg·（kg bw）-1]；②富硒酵母組[富硒酵母7.50 mg·（kg bw）-1]；③姜黃素劑量聯合富硒酵母組[姜黃素16.67 mg·（kg bw）-1+富硒酵母7.50 mg·（kg bw）-1]；④模型組給予50%分析純乙醇（無水乙醇與蒸餾水為1∶1稀釋）一次性灌胃，灌胃量為12 mg·（kg bw）-1；⑤空白組給予蒸餾水。受試樣品每日經口灌胃給予實驗小鼠，空白對照組和模型對照組給予蒸餾水，連續灌胃30 d。小鼠采用標準飼養環境，自由飲食飲水。每天觀察小鼠的攝食、飲水、活動和一般情況，每周稱重2次，按體重調整受試樣品劑量。急性酒精性肝損傷造模于實驗第30天進行，除空白對照組外，其余小鼠給予50%分析純乙醇（無水乙醇與蒸餾水為1∶1稀釋）一次性灌胃，灌胃量為 12 mg·（kg bw）-1，空白對照組給予等量蒸餾水。禁食不禁水16 h后處死動物，取材進行各項指標的檢測及病理組織學檢查。

1.4.1 肝組織勻漿制備

取100 mg肝組織，加入900 μL PBS，振動研磨。充分研磨后，10 000 r·min-1離心10 min，取上清，通過生化試劑盒測定丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、甘油三酯（Triglyceride，TG）及谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的含量。

1.4.2 肝臟組織病理學觀察

小鼠肝臟脂肪沉積采用油紅O染色法，肝臟組織在最佳切削溫度條件下用包埋機進行包埋，獲得冰凍組織切片，用油紅O進行染色，然后在光學顯微鏡下觀察脂滴在肝臟組織中的分布范圍與面積。若脂滴在肝細胞內散在分布和稀少則計0分；若脂滴不超過肝臟組織面積的1/4則計1分；若脂滴不超過肝臟組織面積的1/2則計2分；若脂滴不超過肝臟組織面積的3/4則計3分；若脂滴填充了整個肝臟組織則計4分。

1.4.3 統計學方法

采用Minitab 20統計軟件進行數據分析。計量數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05時認為差異有統計學意義。

1.5 結果判定

以下任何一個結果陽性，即判定該受試樣品對酒精性肝損傷具有輔助保護作用。①肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項檢測結果呈陽性。②肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項指標中任兩項指標陽性和病理組織學檢查結果陽性。

2 結果與分析

2.1 肝臟指數的變化

由表1可知，各組小鼠的初始體重及最終體重均無顯著差異（P＞0.05）。實驗數據表明，相比空白組，模型組（即只喂食酒精）的小鼠肝臟指數顯著增加；與模型組相比，姜黃素組及姜黃素聯合富硒酵母組小鼠肝臟指數下降，且差異具有顯著性，表明姜黃素及姜黃素聯合富硒酵母能夠保護小鼠因急性酒精灌胃導致的肝臟受損腫大。

2.2 肝臟組織TG、MDA、GSH的水平

與空白組相比，模型組小鼠肝臟TG、MDA水平顯著增加（P＜0.05）。急性酒精灌胃后，姜黃素組、富硒酵母組及姜黃素聯合富硒酵母組小鼠的肝臟TG水平較模型組顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，各劑量組小鼠肝臟MDA水平明顯下降，且差異具有顯著性。然而，相比于空白組，模型組小鼠肝臟GSH水平有所上升，但無統計學差異，可能與急性酒精灌胃后GSH水平應激性升高相關。各樣品組小鼠肝臟GSH水平較模型組均明顯升高，且差異具有顯著性（見表2），可見姜黃素單方、富硒酵母單方、姜黃素聯合富硒酵母均可以降低急性酒精性肝臟損傷小鼠肝臟組織TG、MDA水平。另外，從數據也可以看出，姜黃素聯合富硒酵母的效果優于兩種物質單方的結果，說明姜黃素與富硒酵母具有協同的作用。

2.3 肝臟組織脂質沉積情況

油紅O染色實驗結果顯示，少量、小體積、分布均勻的橘紅色小脂滴分散在空白組小鼠肝臟細胞中。大量彌漫性、大小不一的橘紅色脂滴在模型組小鼠肝細胞內聚集，與空白組相比體積增大。而相較于模型組，姜黃素、富硒酵母、姜黃素聯合富硒酵母小鼠肝細胞內橘紅色脂滴數量減少、體積減小，且差異明顯（見圖1）。各組小鼠肝臟組織脂肪肝沉積評分結果如表3所示，相對于空白組，模型組小鼠肝臟病理得分增加，脂肪面積占比顯著升高，且差異具有顯著性（P＜0.05）。與模型組相比，各樣品組小鼠肝臟病理得分有所下降，脂肪面積占比顯著降低（P＜0.05），表明姜黃素單方、富硒酵母單方、姜黃素聯合富硒酵母復方均能夠緩解急性酒精性肝臟脂質沉積。從脂肪面積比的結果看，姜黃素聯合富硒酵母復方具有協同的作用。

3 結論

根據前期學者的研究[9-11，13-15]，本次研究中富硒酵母（硒含量2 000 mg·kg-1）、姜黃素的成人攝入量分別為45 mg·d-1[0.75 mg·（kg bw）-1]、100 mg·d-1[1.67 mg·（kg bw）-1]，其中硒的含量為90 μg·d-1，實驗選用成年雄性C57BL/6J小鼠，樣品分別按人體推薦量的10倍經口灌胃給予受試物，同時設立空白對照組和模型對照組。實驗結果表明，與模型組相比，姜黃素及姜黃素聯合富硒酵母組小鼠肝臟指數顯著降低；姜黃素、富硒酵母及姜黃素聯合富硒酵母組小鼠肝臟組織TG水平顯著下降；各樣品組小鼠肝臟組織MDA水平顯著下降；肝臟組織GSH水平顯著增加。油紅O染色結果顯示，相較于模型組，喂食了姜黃素、富硒酵母和姜黃素富硒酵母組合物的小鼠肝細胞內橘紅色脂滴面積和體積均明顯減少，脂肪面積占比降低，且差異具有顯著性。

根據《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003年版）中判定結果，滿足以下任一條件，可判定受試樣品具有對酒精性肝損傷有輔助保護作用。①肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項檢測指標結果陽性。②肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項指標中任兩項指標陽性和病理組織學檢查結果陽性。本實驗肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項檢測指標以及病理組織學檢查結果均為陽性，判定姜黃素單方、姜黃素聯合富硒酵母復方對化學性肝損傷具有輔助保護功能。

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