在蛋白質化學檢測方法食品安全評估和檢測中的應用

黃章程

（福建賽福食品檢測研究所有限公司，福建福州 350100）

民以食為天，當食品發生安全問題后不僅會使社會的誠信機制受到消極影響，嚴重時還會使廣大人民群眾的生命安全遭遇威脅。進入新時代后，為了有效保障食品安全，提升全民素質，完善了原有的食品安全國家標準體系。但是，在實施過程中并不能從根本上杜絕部分商家通過非法手段從事制假、摻假、售假等違法犯罪活動。因而，在當前階段十分有必要加強對食品安全評估和檢測的研討，利用先進的檢測方法提高其評估和檢測效率及質量，為食品安全管理提供技術支撐等。

1 蛋白質化學檢測方法的基本原理

蛋白質屬于大分子化合物，由氨基酸脫水而來。化學組成元素包括了C、O、N、H、S、P 及微量元素等（圖1），理化特性如下：①氨基酸特性；②高分子性質；③水合作用；④顯色反應等。近幾年蛋白質化學檢測中應用的方法主要有兩種，一種是凱氏定氮法，另一種是高效液相色譜法，兩種方法不僅在檢測原理方面存在較大差異，而且適用范圍有所不同。

圖1 蛋白質組成元素及含量示意

1.1 以凱氏定氮法為例

該方法已有一百多年的歷史，具有可靠性高、應用廣泛的特點。從全球范圍看，多數國家、專業檢驗檢測機構，都將其作為蛋白質檢測方面的標準方法，有效落實到了食品安全評估和檢測之中。目前，我國在食品安全評估和檢測中，將其作為國家標準、行業標準中的重要方法對其進行了推廣應用。從原理方面看，凱氏定氮法包括消化、蒸餾、滴定。具體如下：①消化環節主要是在氧化反應的條件下把被測樣品中的含氮化合物轉化氨氣，同時以硫酸銨的形式分離出其中的氮元素。②蒸餾環節主要是把氨從消化產物中分離出來，并通過滴定方式定量分析溶液內的氨離子。消化、蒸餾、滴定三大檢測步驟對應的化學反應式如下：

1.2 以高效液相色譜法為例

高效液相色譜法（HPLC）屬于色譜法，主要是在經典液相色譜法基礎上發展出來的新型檢測方法，優勢集中表現在應用范圍大、分離速率高、準確度高、靈敏度高等方面，尤其在揮發性化合物、高沸點化合物檢測方面具有較好的應用效果。目前，在國內的食品檢測、環境監測方面，對其進行了推廣應用。從原理方面看，該方法主要是從物化性質差異出發，以液體作為流動相，利用高壓輸液系統、物質溶解度、物質蒸氣壓等，分離物質流動相和固定相色譜柱中的物質組分。以液相色譜柱分離為例，假定分布系數、分離因子分別為a和k，可以根據公式對n個液相色譜柱的分離效率R進行有效計算。具體如下：

2 食品安全評估和檢測中對蛋白質化學檢測方法的應用

自《食品安全標準與監測評估“十四五”規劃》實施至今，國家食品安全管理部門、監督部門、專業檢驗檢測機構，在食品安全評估和檢測中普遍加強了對凱氏定氮法和高效液相色譜法的應用，雖然蛋白質檢測中的兩種方法原理、優勢、劣勢均存在差異（表1），但是在實際應用中可以滿足大部分食品安全精準檢測需求。為了論述的清晰性，下面僅對凱氏定氮法的應用展開具體說明。

表1 蛋白質檢測方法原理及優勢和劣勢

2.1 應用現狀

目前，應用凱氏定氮法時主要是對食品中的蛋白質進行質量檢測。但是，當參考值存在較大不確定性時，不能將該方法作為替代方法實現對測定對象的準確評估。例如，應用該方法建立參考值的過程中，要求檢測人員對凱氏定氮法的性能做進一步驗證，并對其期望范圍進行確認。事實上，應用該方法時牽涉三大檢測步驟，每個步驟中的化學反應比較復雜，通常的測量時間不低于10 h，并不能滿足當前階段食品安全評估和檢測中對快速測定的要求。為了解決該問題，在離子色譜、凱氏消化方面，可以使用抑制電導檢測方法，進而使消解時間降至1 h 以內，同時省去該方法中的其他兩個步驟，進而使分析時間大幅度降低，達到食品安全評估和檢測中對其準確度和精密度的要求。再如，部分不良商家為了牟取暴利，會選擇在食品中摻假牛奶生乳蛋白，此時檢測人員可以利用非蛋白質氮（NPN）指數概念，將該方法與三氯乙酸沉淀法（TCA）進行聯合應用，完成對一系列牛奶樣品非蛋白質氮和蛋白質氮的檢測。以三聚氰胺為例，當摻假牛奶中的含量小于0.2 mg/kg 時NPN 指數可達到可辨識范圍（最小值為0.8084，最大值為1.4987）。檢測人員可以根據該條件，應用上述兩種方法的聯合檢測方式，更為精準地完成對富含氮的摻假牛奶質量檢測工作。

2.2 實驗分析

2.2.1 實驗材料

儀器主要包括UV-1800紫外可見分光光度計，石墨消解儀。試劑如下：實驗試劑為聚乙烯醇，基準物為氯化銨、碳酸鈉，分析純包括過氧化氫（30%），溴甲酚綠，甲基紅，鹽酸，氫氧化鈉，硼酸，硫酸銅、硫酸鉀，硫酸，碘化汞（CP），碘化鉀。實驗食品共計7種，分別為清蒸豬肉、原法鯖魚、蠶豆、午餐肉、紅燒肉、咖啡雞、菜籽粕。

2.2.2 實驗方法

首先，實驗人員按0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL、2.8 mL、4.0 mL，吸取含N 量為40 mg/mL 的標準氯化銨溶液，通過聚乙烯醇液（0.1 mg/mL）對其進行稀釋處理后，量取奈氏試劑1 mL，加入稀釋液，加入量以25 mL 為準，然后采用比色法在460 nm 位置進行比色，獲取蛋白質過氧化凱氏定氮法標準曲線y=0.034 2x+0.121 6，R2=0.9989。

其次，采用電子天平秤取0.25 g 樣品，將其置于凱氏定氮管中，然后添加硫酸4 mL，置于石墨消解儀上300℃加熱3 min 后，以2 mL/min 的速度添加消化劑15 mL（過氧化氫和硫酸比例為4：1）繼續在石墨消解儀上350℃溫度加熱2 min，完成對過氧化劑的處理后，取出消解管，冷卻后轉移并定容至100 mL。按照比色法吸取0.4 mL 樣品進行比色。

第三，根據GB 5009.5—2016標準要求，應用過氧化凱氏定氮法對樣品中的蛋白質含量進行測定。為了說明該方法的測定優勢，實驗人員同時應用常規凱氏定氮法對樣品中的蛋白質進行了測定，記錄了相關測定數據，比較了常規法、過氧化法的精密度等。

2.2.3 實驗結果和討論

實驗結果顯示，在7 個樣品中，應用過氧化法測定的蛋白質含量在37.62%～38.71%，CV 為0.44%。常規法測定下的對應數據為28.0%～38.5%、0.53%。應用F 檢驗比較后發現，兩種方法的精密度不具有顯著差異，基本相同。但是，通過對清蒸豬肉、原法鯖魚、蠶豆、午餐肉、紅燒肉、咖啡雞、菜籽粕七種食品的蛋白質含量測定后，發現二者的對應差值，分別為+0.19、+0.73、+0.16、+0.38、-0.45、+0.70、-22。根據數理統計理論，對兩種方法進行比較分析：①當測定次數增多后，兩種方法測定值減差值應等于0；②在有限測定次數內，二者的減值不一定等于0，而且與0之間不存在顯著差異。對應到統計檢驗方面，檢驗假定條件是H0：u=u0，備樣假設條件為H1：u≠u0。假定顯著性水平α=0.05，那么，本例中的拒絕域|t|＞t0.05，6=2.45，由此說明檢驗假定條件成立，兩種方法的測定結果趨于一致。

但是，在測定結果影響方面，應用過氧化劑（ 按0 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL）后，消化時間在2.5～15.0 min，蛋白質含量范圍在27.98%～29.98%。經過比較發現，當過氧化劑使用量為5 mL，滴速為2 mL/min 時，菜籽粕蛋白質量含量測定結果方面，基本趨于恒定。對其他樣品進行測定后，發現15 mL 的過氧試劑應用效果相對較好，在滴速不變的情況下消化時間約在7.5 min。從樣品氮回收率方面看，硫酸與過氧化氫發生反應后，主要生成的水和HS03OOH 的，根據文獻報道和本次實驗經驗看，按4：1的比例應用30%過氧化氫和氧化劑硫酸，能夠起到較好的氧化效果，加速消化速度。

2.2.4 實驗結論

通過實驗結果與討論說明，在食品蛋白質含量測定中，應用過氧化法，有利于提高凱氏定氮法的應用效率，實用性相對較高。

3 結束語

食品安全評估和檢測在當前階段已變得十分重要，成為食品安全國家標準體系的核心內容。建議在實踐中選擇蛋白質化學檢測方法時，先對不同方法下的基本原則全面分析，再根據不同方法的適用范圍對其進行應用。建議在食品評估和檢測實踐中，一方面選擇凱氏定氮法對食品蛋白質質量進行檢測，另一方根據面高效液相色譜法的適用范圍，將其應用到對食品蛋白質含量檢測方面，進而提高該方法的應用效果。