分子熒光光度法測定黃芩中黃芩苷的含量

周曉霞

(衡水學院 化工學院,河北 衡水 053000)

黃芩苷(Baicalin)是一種從黃芩根中提取分離出來的黃酮類化合物,是黃芩的主要活性成分,具有顯著的生物活性[1-2]。研究表明,黃芩苷具有抑菌、清熱、降壓、鎮靜、抗氧化、抗纖維化、抗變態反應等作用[3],還可以抗腫瘤和HIV[4]等疾病。黃芩是十分重要的中草藥,作為黃金草藥的一種,在臨床上的使用已逾兩千年。黃芩不僅能夠治療多種疾病,還可以用于預防一些病癥。黃芩苷對黃芩來說是一種非常關鍵的有效成分。目前關于黃芩苷的研究主要集中在對藥物的提取分離方面,對于含量測定報道較少。

迄今為止測定黃芩苷含量有熒光分光光度法[5]、高效液相色譜法[6]、薄層色譜技術[7]、紫外分光光度法[8]、高效毛細管電泳法、微乳液相色譜法[9]等方法。高效液相色譜法測定黃芩苷含量相對準確,但對于儀器設備要求高,檢測周期長[10]。紫外分光光度法對于黃芩苷含量的測定成本高,具有一定的局限性。熒光分光光度法靈敏度高、選擇性好、操作方便,而且被廣泛應用于食品、藥品和環境的檢測。本文欲采用分子熒光光度法測定黃芩中黃芩苷的含量,從而建立一種可行而又簡便的定量測定黃芩苷的實驗方法。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

黃芩苷,成都普菲德生物技術有限公司;5.000 μg·mL-1黃芩苷標準儲備溶液;0.10 moL·L-1硼砂溶液;1.0 moL·L-1氫氧化鈉溶液;1%吐溫-80溶液;1%十二烷基硫酸鈉溶液。本實驗所用試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器

FA2204B 電子天平,上海精密科學儀器股份有限公司;F-7000 熒光分析儀,日立。

2 實驗結果與討論

2.1 激發光譜波長與發射光譜波長的確定

取1支10 mL比色管,移取已配制好的5.000 μg·mL-1的黃芩苷標準溶液1 mL,固定激發波長Ex,掃描發射波長Em,固定發射波長Em,掃描激發波長Ex。重復上述步驟多次,直至找到激發(發射)波長對應的熒光值最強且穩定不變時為止,得到黃芩苷溶液的最佳激發波長為270 nm,最佳發射波長為547 nm。

2.2 黃芩苷溶液在不同硼砂濃度下熒光強度的變化

黃芩苷本身的熒光性比較弱,因此需要硼砂作為熒光增敏物質來增強其熒光強度。

準備6支10 mL具塞比色管,分別加入配制好的5.000 μg·mL-1的黃芩苷溶液,再向其分別加入硼砂溶液,使硼砂溶液濃度分別為0.002,0.004,0.008,0.012,0.016,0.020 moL·L-1。分別測定黃芩苷在相應硼砂濃度下的熒光強度值,所得到的實驗結果如圖1所示。

圖1 不同硼砂濃度與黃芩苷熒光強度的關系

由圖1可以看出黃芩苷的熒光強度值隨著硼砂濃度的增加而不斷增大,硼砂濃度越大,黃芩苷與硼砂結合的效果越好,熒光強度就越高。本實驗選用熒光增敏劑硼砂溶液,使其濃度為0.020 moL·L-1。

2.3 黃芩苷在不同酸度下的熒光強度

實驗發現溶液在弱堿性環境下,基本上不產生熒光峰,而pH值>11時,熒光強度逐漸發生變化。

準備11只10 mL的比色管,分別加入5.000 μg·mL-1的黃芩苷溶液、加入適量硼砂溶液使其濃度為0.020 moL·L-1,滴加已配制好的氫氧化鈉溶液,通過pH計調節待測溶液的pH值,根據酸堿性,分別在pH值為11.0,11.4,11.6,11.9,12.1,12.3,12.6,12.9,13.1,13.2,13.6時測定不同pH值下的待測溶液的熒光強度值,測定的實驗結果如圖2所示。

圖2 pH值與熒光強度的關系

觀察圖2可知,黃芩苷的熒光強度在pH值>11之后發生明顯變化,pH值在11～12.5熒光強度值不斷增大,pH值>12.5時,熒光強度值開始逐漸減小。由圖可知,黃芩苷在pH值為12.5時熒光強度最高。

2.4 黃芩苷標準曲線的測定

在上述最佳條件下進行實驗,配制一系列濃度梯度的黃芩苷標準溶液:精確配制質量濃度為0.500,1.000,1.500,2.000,2.500 μg·mL-1的黃芩苷溶液。

準備5支10 mL的具塞比色管,分別移取5.000 μg·mL-1的黃芩苷溶液,加入適量硼砂溶液使其濃度為0.020 moL·L-1,并保持溶液的pH值為12.5,分別測定其熒光強度值,測定結果如圖3所示。

圖3 黃芩苷溶液標準曲線

通過數據分析可得,線性方程為:y=176.89+82.14x,R2=0.999 1。

2.5 樣品的測定

對黃芩藥材樣品進行預處理。利用一種采樣器,可以將購買的黃芩藥材粉碎成粉末并過篩,用分析天平準確稱取0.050 0 g于小燒杯中,加入無水乙醇溶解,并用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中,浸泡提取24 h。過濾,將濾液轉移到100 mL容量瓶中,然后用蒸餾水定容至刻度線,搖勻貼上標簽,備用。

準備3支10 mL具塞比色管,分別移取黃芩藥材樣品溶液,調至上述最佳條件下測定其熒光強度,結果見表1。根據黃芩苷溶液標準曲線線性方程計算相應的黃芩苷含量,平行測定三次求平均值。

表1 黃芩藥材樣品的熒光強度

通過線性回歸方程y=176.89+82.14x,R2=0.999 1計算可得,黃芩藥材中的黃芩苷含量平均值為1.685 μg·mL-1。

3 結論

通過實驗得出適宜條件:

1)黃芩苷的最大激發波長為270 nm,最大發射波長為547 nm。

2)硼砂溶液濃度為0.020 moL·L-1,為本實驗熒光增敏物質;實驗最佳pH值為12.5。

3)上述條件下,測定得出黃芩苷溶液在0.50～2.5 μg·mL-1質量濃度范圍內與其熒光強度呈線性關系,線性方程為:y=176.89+82.14x,R2=0.999 1,在最佳條件下測定了所選擇黃芩藥材中黃芩苷的含量為1.685 μg·mL-1。

實驗表明,可以通過分子熒光光度法來測定黃芩中黃芩苷的含量,本方法實現了不經分離,即可測定物質的含量,為定量分析黃芩中黃芩苷的含量建立了一種可行且簡便的方法,這些結論對于黃芩以及黃芩苷的進一步探究提供了積極意義。